Утверждены
Минздравом СССР
31 августа 1973 г. N 1112-73
27 сентября 1978 г. N 1914-78
19 октября 1979 г. N 2067-79
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БМК И БЕНЛАТА ПО БМК В РАСТИТЕЛЬНЫХ
ОБЪЕКТАХ, ВИНЕ, ПОЧВЕ И ВОДЕ МЕТОДОМ
ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны: К.Ф. Новиковой,
Л.И. Лещинской (ВНИИХСЗР) [1]; Г.И. Крамаренко (ВИЛР); В.А. Сигаевой
(Институт биофизики) [2]; Н.В. Бажановой, К.В. Аветисян
(АрмНИИЗР) [3].
Краткая
характеристика препарата. Бенлат (фундазол, беномил, Д-1991) -
системный фунгицид,
рекомендуемый для борьбы
с грибковыми болезнями
растений (парша,
серая гниль и
т.д.). Действующее начало
препарата
N-(1-бутилкарбамидобензимидазолил-2)-O-метилкарбамат.
Брутто-формула
C H NO .
Молекулярная масса 290,0. В чистом виде - белые кристаллы, т. пл.
14 18 3
290 °C (с
разложением). Практически нерастворим в воде, плохо
растворим в
органических растворителях. В пищевых продуктах растительного
происхождения
МДУ 0,5
мг/кг, в сахарной
свекле, пшенице 1 мг/кг. В растениях, воде и
почве бенлат быстро гидролизуется до
БМК.
БМК (бавестин, карбендазим, БАС-346) - системный фунгицид с аналогичной
бенлату областью
применения. Действующее начало препарата - метиловый эфир
2-бензимидазолилкарбаминовой
кислоты. Брутто формула C H N O . Молекулярная
9 9 3 2
масса 191,3. В
чистом виде - белые кристаллы,
т. пл. выше 300 °C.
При 300 °C
возгоняются с разложением, которое начинается
при 230 °C.
Растворимость в
100 г растворителей
при 20 °C,
г: для воды - 0,01;
этилового спирта
- 0,04; ацетона - 0,03; циклогексана - 0,001; бензола -
0,001;
хлороформа - 0,01. В сахарной
свекле МДУ 0,1 мг/кг. В
огурцах,
яблоках,
винограде, землянике, черной
смородине содержание БМК
не
допускается.
Принцип метода. Метод основан на
извлечении бенлата и БМК из анализируемых объектов этилацетатом,
очистке экстракта перераспределением в соляную кислоту, а затем, после
подщелачивания раствора, в этилацетат и определении БМК методом ТСХ.
Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения в хроматографируемой
пробе: на УФ пластинках - 3 мкг [1]; 5 мкг при проявлении пластинки бромфеноловым реагентом [2]; 10 мкг при проявлении пластин
фосфорно-молибденовой кислотой [3|. Предел определения в исследуемых объектах,
мг/кг: арбузы, яблоки, огурцы - 0,1; семена хлопка, льна - 0,2; семена мака,
шиповника, в подорожнике - 0,3; в почве - 0,15; воде - 0,02; в вине -
0,1 мг/л. Среднее значение определения стандартных количеств бенлата и БМК при n = 15 во всех объектах - 80,0%.
Стандартное отклонение при n = 15 +/- 7,1%. Доверительный интервал среднего при
p = 0,95 и n = 5 80 +/- 9%. Размах варьирования для всех объектов 70,0 - 90,0%.
Избирательность метода. Метод селективен. Цирам, цинеб, ТМТД, каптан и другие
определению не мешают.
Реактивы
и материалы. Ацетон
х.ч.
Хлороформ свежеперегнанный, х.ч.
Этилацетат свежеперегнанный, х.ч. Этиловый спирт, 96-процентный. Гексан
х.ч. Циклогексан х.ч. Аммиак, 30-процентный раствор. Гидроксид
натрия 4 н.
Безводный сульфат
натрия х.ч.
Хлороводородная кислота,
0,1 н раствор.
Ледяная уксусная
кислота.
Фосфорно-молибденовая
кислота ч.д.а.,
1-процентный раствор
в этиловом спирте.
Нитрат серебра ч.д.а.,
1-процентный. Бромфеноловый синий ч.д.а.,
0,05-процентный раствор в
ацетоне.
Проявляющий реагент: 1-процентный
водный раствор азотнокислого
серебра и
0,05-процентный раствор бромфенолового синего
смешать перед
употреблением (1:1).
Лимонная кислота, 2,5-процентный
раствор. Пластинки
"Силуфол" УФ . Стандартный раствор БМК в ацетоне с содержанием
100 и
254
10 мкг/мл.
Раствор стабилен при хранении в холодильнике 6 мес.
Приборы, аппаратура, посуда. Аппарат для
встряхивания. Ротационный вакуумный испаритель. Кофейная мельница. Почвенное
сито. Лампа УФ-света типа "Хроматоскоп" или
аналогичная с диапазоном излучения 250 - 260 нм.
Воронки делительные на 500 и 1500 мл. Колбы: конические на 250 мл; круглодонные
на 250 мл; грушевидные на 50 мл; плоскодонные на 500 мл; мерные на 100 мл.
Мерные цилиндры. Центрифужные пробирки на 10 мл;
градуированные с оттянутым кончиком; пипетки на 10; 5; 1 и 0,1 мл.
Подготовка к определению. Хроматографические камеры заполняют системами подвижных
растворителей за 1 ч до начала хроматографирования
для насыщения парами растворителей.
Ход анализа. Экстракция и очистка
экстракта. Образец из огурцов, яблок, арбузов с помощью ножа
измельчают на кусочки размерами 0,5 x 0,5 x 0,5 см, отбирают среднюю пробу 30
г. Навеску пробы помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают 100 мл
этилацетата и экстрагируют фунгицид с помощью механического встряхивания в
течение 30 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку
на 500 мл. Экстракцию повторяют еще 2 раза этилацетатом порциями по 75
мл. Из объединенного экстракта БМК извлекают реэкстракцией
0,1 н HCl 3 раза по 50 мл. Объединенный солянокислый
экстракт дважды промывают гексаном порциями по 30 мл.
Гексановый слой отбрасывают. К солянокислому раствору
добавляют 4 мл 4 н раствора едкого натра (до pH 10) и
трижды экстрагируют БМК этилацетатом порциями по 50 мл. Этилацетатный
экстракт сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют в круглодонную колбу
вместимостью 200 мл и с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью
отгоняют растворитель.
Пробу из семян хлопка, льна, зерна [1]
измельчают с помощью кофейной мельницы до размера частиц, равных размеру частиц
манной крупы. Навеску в 15 г помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, заливают
этилацетатом (100 мл), а затем проводят экстракцию БМК и очистку экстракта, как
указано для огурцов.
Пробу вина (30 мл) помещают в делительную
воронку на 300 мл и трижды экстрагируют БМК этилацетатом порциями по 50 мл.
Дальнейшую очистку экстракта проводят по схеме, описанной для огурцов.
Пробу подорожника, семян мака, плодов шиповника
[7] массой 10 г измельчают (кроме мака), заливают 100 мл этилацетата и
экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 1,5 ч. Добавляют безводный
сульфат натрия и отфильтровывают через бумажный фильтр в делительную воронку.
Промывают растительную пробу 2 раза этилацетатом порциями по 50 мл и
отфильтровывают в ту же делительную воронку. Экстрагируют БМК трижды 0,1 н
раствором соляной кислоты порциями по 50 мл. Объединенный солянокислый раствор
2 раза промывают петролейным эфиром (т. кип. 70 - 100
°C) порциями по 50 мл. К солянокислому раствору добавляют 4 н раствор едкого
натра до pH 10. Далее поступают так, как описано для
огурцов.
Просеянную через
почвенное сито почву [1] растирают в ступке, отбирают навеску в 20 г, переносят
ее в колбу на 500 мл, тщательно увлажняют водой (5 мл), а затем заливают 100 мл
этилацетата и экстрагируют БМК с помощью механического встряхивания в течение 1
ч. Экстракцию повторяют еще 2 раза этилацетатом порциями по 50 мл. Каждую порцию экстракта фильтруют в делительную воронку, и дальнейшее
определение проводят по схеме, описанной для огурцов.
Воду (1 л) помещают в делительную воронку
на 1500 мл, добавляют около 30 г NaCl, затем по
каплям - 4 н едкий натр до pH 10 и экстрагируют БМК
этилацетатом порциями один раз по 100 мл и 2 раза по 50 мл [1]. Дальнейшую
очистку объединенного экстракта проводят по схеме, описанной для огурцов.
Хроматографирование. Сухой остаток после удаления растворителя
смывают
количественно с
помощью 2 - 3 мл ацетона в пробирку с оттянутым кончиком. В
пробирку помещают
заплавленный
сверху стеклянный капилляр
и упаривают
ацетон, нагревая
пробирку на горячей водяной бане до объема около 0,1 мл.
Остаток с
помощью того же капилляра, но с отломанным
заплавленным
концом,
наносят на хроматографическую пластинку. Параллельно на пластинку
наносят
серию стандартных
растворов БМК с
содержанием 3; 4; 5; 6; ...; 10 мкг.
Хроматограмму
развивают либо в
системе
этилацетат-хлороформ-ледяная
уксусная кислота
(50:50:10), либо в системе
толуол-этилацетат-этиловый
спирт-аммиак
(60:10:20:2). БМК проявляется при облучении пластин под лампой
УФ-света в виде
синих флюоресцирующих пятен на желтом фоне с R в первом
f
случае 0,37 +/-
0,02, во втором - 0,47 +/- 0,01. Для
проб вина можно
использовать лишь
вторую систему, так
как в первой
на уровне БМК
присутствуют пятна
неизвестных коэкстрактивных веществ. Линейный
диапазон
определения 3 -
10 мкг. Пятна стабильны несколько месяцев [1].
Экстракты подорожника, мака и шиповника [2] хроматографируют
в системе
хлороформ-ацетон-циклогексан-уксусная кислота
(7:1:2:1), R БМК в этой
f
системе 0,38 +/-0,02.
Если хроматограмму развивали на пластинке
"Силуфол"
без флюоресцентной добавки, то хроматограмму
обрабатывают из пульверизатора
1-процентным спиртовым
раствором
фосфорно-молибденовой
кислоты. После
выдерживания пластинки в течение 15 мин. под УФ-светом
БМК проявляется в
виде
желтовато-белых пятен на
бледно-голубом фоне. Нижний
предел
определения 10 мкг в пробе [3].
Линейный диапазон определения 10 - 20 мкг.
Хроматограмму на пластинке "Силуфол"
без флюоресцентной добавки можно также
обрабатывать после
нагревания в сушильном шкафу при
температуре 100 °C в
течение 5 - 10 мин.
смесью азотнокислого серебра с бромфеноловым синим и
после 2 - 5 мин.
нагревания в сушильном шкафу
снимают фон 2,5-процентным
раствором
лимонной кислоты.
На хроматограммах
БМК проявляется в виде синих пятен на лимонном фоне [2]. Линейный диапазон
определения 5 - 10 мкг.
Обработка результатов анализа. Содержание
БМК в пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:
A
X = -,
P
где:
A - количество БМК, найденное в хроматографируемой пробе методом соотношения со
стандартами, мкг;
P - навеска или объем исследуемой пробы, г или мл.
Требования безопасности. Необходимо
соблюдать правила безопасности, рекомендуемые для работы с
легковоспламеняющимися жидкостями.