Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
19 октября 1979 г. N 2085-79
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АКТЕЛЛИКА В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ,
В ПОЧВЕ И В ВОДЕ ХРОМАТОГРАФИЕЙ В ТОНКОМ СЛОЕ
И НА ГАЗОВОМ ХРОМАТОГРАФЕ
Настоящие Методические указания
предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и
научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных,
агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и
лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных
количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней
среде.
Методические указания апробированы и
рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по
химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при
МСХ СССР.
Методические указания согласованы и
одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы
ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского
и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении
Минздрава СССР.
1. Краткая
характеристика препарата
1.1. Актеллик
1.2.
0,0-диметил-0-(диэтиламино-6-метилпиримидил-4)тиофосфат
1.3. Структурная формула:
CH O S CH
3 \|| --- / 3
P-O-// \\N
/
\ ___ /
CH O N --- C H
3 \ / 2 5
N
\
C H Мол. масса = 305,35.
2 5
1.4. Пиримифос-метил,
ПП-511, актеллик
1.5.
Химически чистое вещество актеллика
представляет собой жидкость
светло-желтого цвета.
Хорошо растворяется в
большинстве органических
растворителей, слабо растворим в
воде - 5
мг/л при температуре 30°.
-4
Удельный вес
- 1,157 при
30°, давление пара - 1 х 10 . Разрушается в
сильнокислых и
щелочных средах.
Препарат малотоксичен
для теплокровных животных - при оральном введении
ЛД для
мышей составляет 1180 мг/кг. Препарат опасен для птиц
(ЛД 30 -
50
50
60 мг/кг) и рыб (ЛД 0,3 -
27 мг/кг).
50
Выпускается в форме 25-процентного
концентрата эмульсии, 25-процентного препарата для ультрамалообъемного
опрыскивания.
2. Методика
определения актеллика
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Метод
основан на извлечении
актеллика
из растительных проб и воды
органическими
растворителями (хлороформом, 10 - 20-процентным ацетоном в
гексане или
50-процентным водным ацетоном). Из
почвы экстрагируют
инсектицид смесью
ацетона с 0,05 н
раствором CaCl . Очистка экстрактов
2
способом
перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями и на
хроматографических
колонках.
Количественное определение проводят
хроматографическим
в тонком слое
методом или на газовом
хроматографе с
термоионным
детектором.
2.1.2. Метрологическая характеристика
метода
ГЖХ ТСХ
Минимально детектируемое
количество 10 нг 0,5 - 3 мкг
Нижний предел
определения 0,002
мг/кг 0,1 мг/кг
P - размах
варьирования, %
в растениях 85,0 - 91,0 86,0 - 91,5
в почве 92,5 - 97,5 92,5 - 97,6
_
с - среднее значение определения, %
в растениях 88,5 85,5
в почве 95,0 95,0
S - стандартное
отклонение, %
в растениях 2,5 2,5
в почве 2,5 2,5
Доверительный
интервал среднего при
P = 0,95 и n =
5, %
для растений 88,5 +/- 2,5
для почвы 95,0 +/-
2,5
2.1.3. Избирательность метода
Другие фосфорорганические инсектициды
определению не мешают.
2.2. Реактивы и растворы
Хлороформ, х.ч.,
ГОСТ 3160-51, - CHCl .
3
Гексан, х.ч., МРТУ 6-09-2937-66, - CH (CH )
CH .
3 2 4 3
Ацетон, ч., ГОСТ 2603-63, - CH COCH .
3 3
Ацетонитрил, ч.,
МРТУ 6-09-6448-69, - CH CN.
3
Диметилформамид,
ч., МРТУ 6-09-2068-65, - HCON(CH ) .
3 2
Бензол, ч.д.а.,
ГОСТ 5955-68, - C H .
6 6
Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-66, - Na SO .
2 4
Уголь
активированный марки КАД - молотый или ОУ-А.
Окись алюминия для хроматографии, МРТУ
6-09-5296-68-4, - Al O .
2 3
Силикагель КСК или пластинки "Силуфол UV-254".
5% SE-30 на хроматоне
N-AW-ДМСS (0,16 - 0,20 мм).
Азот, осч.
Водород.
Проявляющие реагенты:
0,5-процентный раствор 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане, после
опрыскивания нагревание пластинки при 110° в течение 5 мин.
0,5-процентный раствор бриллиантового
зеленого в ацетоне, затем экспозиция пластинки в парах брома 20 - 30 сек.
0,05-процентный раствор бромфенолового синего в 0,5-процентном растворе
азотнокислого серебра, приготовленного на ацетоне. После проветривания хроматограммы и прогревания ее в термостате при 35 - 40°
вновь опрыскивают 5-процентным раствором уксусной кислоты (лимонной кислоты).
2-процентный раствор 4-(P-нитробензил)пиридина в ацетоне
после нагревания хроматограммы при 110° в течение 5
мин. вновь опрыскивают 10-процентным раствором тетраэтиленпентамина
в ацетоне.
Реактив Драгендорфа:
раствор А - 0,85 г азотнокислого висмута растворяют в
смеси 40 мл дистиллированной воды и 100 мл 40-процентной серной кислоты (серную
кислоту можно заменить 10 г винной кислоты); раствор Б - 8 г йодистого калия
растворяют в 20 мл воды. Растворы А и Б смешивают.
Перед употреблением к 6 мл полученной смеси приливают 6 мл 20-процентной серной
кислоты (или 12 г винной кислоты) и доводят объем до 25 мл водой.
Стандартный раствор актеллика
в ацетоне или в гексане - 1,0 - 5,0 мкг/мл.
2.3. Приборы и посуда
Колбы конические со шлифами и пробками на
50 и 250 мл, ГОСТ 10394-72.
Колбы круглодонные со шлифами для отгонки
растворителей, ГОСТ 10394-72.
Делительные воронки на 50 и 100 мл, ГОСТ
8613-75.
Воронки, ГОСТ 8613-75.
Колбы мерные, ГОСТ 1770-74.
Колонки для адсорбционной хроматографии
(300 х 15 мм), МРТУ 42-2590-66.
Аппарат для встряхивания колб.
Ротационный вакуумный испаритель, МРТУ
42-2589-66.
Холодильник бытовой.
Термостат.
Хроматографическая камера, ГОСТ 10565-63.
Микропипетки 0,1 - 0,2 мл, ГОСТ 20292-74.
Хроматоскоп (хемоскоп).
Камера для опрыскивания, ГОСТ 10565-63.
Опрыскиватель, ГОСТ 19391-68.
Микрошприцы на 10 мкл.
Газовый хроматограф с термоионным
детектором (ДТИ).
2.4. Подготовка к определению
Растительную пробу (овощи, фрукты,
зеленую массу) измельчают ножом на кусочки 0,5 х 0,5 х 0,5 куб. см и отбирают
среднюю пробу 25 г.
Почву в естественном состоянии или
воздушно-сухую просеивают через сито и для анализа отбирают 10 г.
Проба воды - 100 мл.
2.5. Проведение определения
2.5.1. Экстракция и очистка экстрактов
Анализируемые навески помещают в
конические колбы емкостью 250 мл, пробы воды - в делительные воронки, куда
добавляют по 10 г хлористого натрия.
Из растений актеллик
экстрагируют трижды по 50 мл 20-процентного ацетона в гексане
либо 50-процентным водным ацетоном, либо 50 мл хлороформа; из почвы - 50 мл
смеси ацетона с 0,05 н водным раствором хлористого кальция (1:1); из воды -
хлороформом порциями: 120, 100, 75 мл. Экстрагируют при встряхивании в течение
1 часа. Экстракты отфильтровывают через бумажный фильтр. Объединенные экстракты
помещают на 1 час в холодильник. При выпадении осадка пробы следует
отфильтровать вторично. Экстракты подвергаются очистке:
а) очистка после экстракции 20-процентным
ацетоном в гексане. Экстракт помещают в делительную
воронку и отделяют водно-ацетоновую фракцию от гексановой.
Водно-ацетоновую фракцию промывают гексаном еще два
раза. Объединенные гексановые экстракты фильтруют
через слой безводного сернокислого натрия, концентрируют под вакуумом при 40 -
50° до 5 мл. После охлаждения добавляют к ним 5 мл холодного ацетонитрила. Ацетонитрил можно
заменить диметилформамидом, однако с первым
растворителем очистка происходит значительно лучше. Пробу встряхивают 1 - 2
мин. Гексановый слой отделяют в делительной воронке и
вторично дважды чистят пробу ацетонитрилом (диметилформамидом), если это необходимо. Ацетонитрильные
(диметилформамидные) экстракты объединяют, переносят в делительную воронку,
добавляют к ним 30 мл воды и 20 мл гексана,
встряхивают 1 - 2 мин. и после разделения слоев гексановый
отделяют, а водно-ацетонитрильный еще раз промывают гексаном
и отбрасывают. Объединенные гексановые экстракты
сушат безводным сернокислым натрием путем фильтрования и концентрируют под
вакуумом до 5 мл. Если проба очищена недостаточно, то ее следует пропустить
через колонку (30 см х 1,5 см), заполненную слоем сернокислого натрия (2 - 3
см), окиси алюминия для хроматографии (3 см), активированного угля КАД -
молотый или ОУ-А (3 см) и безводного сернокислого натрия (1 см). Предварительно
через колонку пропускают 40 - 50 мл хлороформа для уменьшения сорбционной
емкости угля. Из колонки актеллик элюируют
120 мл хлороформа при отсасывании с помощью водоструйного насоса. Хлороформ
концентрируют до объема 0,3 - 0,5 мл и количество инсектицида определяют хроматографическими методами;
б)
очистка после экстракции хлороформом. Полученный экстракт фильтруют
через слой
безводного сернокислого натрия и концентрируют под вакуумом до
0,5 -
1,0 мл. Остаток растворителя
испаряют на воздухе. К сухому остатку
приливают 30 мл
смеси ацетона с 0,05 н CaCl (соотношение компонентов 1:1),
2
пробу переносят
в делительную воронку,
фильтруя через бумажный фильтр,
колбу споласкивают еще 20 мл смеси ацетона с CaCl . В воронку добавляют 30
2
мл гексана для
извлечения токсиканта. Гексановую фракцию
отделяют,
водосолеацетоновую
промывают еще два раза гексаном по 20 мл. Объединенный
гексановый
экстракт фильтруют через
безводный сернокислый натрий
и
концентрируют до
0,3 - 1,0
мл. Если проба очищена
недостаточно, то ее
дополнительно
чистят на колонке, как указано выше;
в) очистка после экстракции водным
ацетоном. Объединенные экстракты переносят в делительную воронку, добавляют 30
мл гексана для извлечения токсиканта.
Далее поступают так, как описано в способе очистки "б".
Экстракты из почвы очищают путем переэкстракции в н-гексане
(смотри способ "б").
2.5.2. Хроматография в тонком слое
На расстоянии 2 см
от нижнего края хроматографической пластинки с тонким
слоем силикагеля, в который внесен флуоресцеин, или
на "Силуфол UV-254" наносят
сконцентрированные экстракты проб и стандартный раствор актеллика
в виде пятен диаметром не более 0,5 см. Если в пробе содержится много
инсектицида, то рекомендуется брать часть пробы или наносить экстракт в 4 - 5
точек. Стенки колб тщательно смывают
несколькими каплями растворителя, который также наносят в центр пятна. Хроматографические пластинки ставят в камеру для хроматографирования и ожидают, пока фронт растворителя
поднимется на высоту 10 см. Хроматографируют в
системе гексан - ацетон (5:1) или гексан
- этилацетат (7:3). Далее пластинку подсушивают на воздухе и проявляют одним из
проявляющих реагентов. Следует указать, что наибольшей чувствительностью
обладает проявитель с 2,6-дибром-N-хлорхинонимином и 4-(P-нитробензил)пиридином.
Пластинки со слоем силикагеля, в который
внесен флуоресцирующий краситель, или пластинки "Силуфол
UV-254" можно просматривать в хроматоскопе, не проявляя их. Инсектицид
определяют по тушению флуоресценции.
R актеллика в системе
гексан
- ацетон (5:1) составляет 0,75, а
в
f
системе гексан - этилацетат (7:3) - 0,51.
Содержание актеллика
в исследуемом объекте вычисляют по формуле:
A х 1000
X = --------,
P
где:
X - содержание препарата в пробе, мг/кг;
A - количество препарата, найденное в
пробе при сравнении со стандартом, мкг;
P - навеска исследуемой пробы, г.
2.5.3. Газохроматографическое определение
После отгонки растворителя к сухому
остатку добавляют 1 или <...> мл гексана, колбу
закрывают пробкой, тщательно обмывая ее внутреннюю поверхность. Аликвотную часть
пробы (2 - 5 мкл) вводят в испаритель хроматографа.
Условия
хроматографирования: хроматограф
с термоионным детектором
(ДТИ),
колонка стеклянная, заполненная
5% SE-30 на хроматоне N-AW-ДМСS
(0,16 - 0,20
мм). Температура колонки 190°, испарителя 230°. Скорость газа-
-11
носителя азота
60 мл/мин. Фоновый ток (1 - 4) х 10 А,
рабочая шкала
-10
электрометра 2,5 х 10
А. Время удерживания
актеллика
в указанных
условиях 2,8 мин.
Содержание
актеллика
в пробе определяют
методом стандартов и
рассчитывают по
формуле:
H х V х
C х V
2 1
1 3
X =
-----------------,
H х V х
P
1 2
где:
X - количество препаратов в пробе, мг/кг;
C -
количество препарата в стандартном растворе, мкг/мл;
1
H -
высота пика стандартного раствора, мм;
1
H -
высота пика анализируемого раствора, мм;
2
V -
объем стандартного раствора, введенного в хроматограф, мкл;
1
V -
объем анализируемого раствора, введенного в хроматограф, мкл;
2
V -
объем экстракта пробы для анализа, мл;
3
P - навеска пробы, г.
2.6. Обработка результатов анализа
приведена в 2.5.2 и 2.5.3.
2.7. Авторы
Настоящая методика включает разработки
авторских коллективов:
1. Петрова Т.М., Андреев Ю.Б., Всесоюзный
научно-исследовательский институт защиты растений, г. Ленинград.
2. Красных А.А., Всероссийский
научно-исследовательский институт защиты растений, пос. Рамонь Воронежской
области.