Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
28 января 1980 г. N 2124-80
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ПРОПАНИДА,
ЛИНУРОНА, МОНОЛИНУРОНА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В ВОДЕ, ПОЧВЕ
И РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ <*>
--------------------------------
<*> Л.Л. Кныр, В.П. Сухопарова,
М.С. Соколов (Институт агрохимии и почвоведения АН СССР, г. Пущино).
Настоящие Методические указания
предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских
учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических,
контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других
министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и
биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и
рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по
химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при
МСХ СССР.
Методические указания согласованы и
одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы
ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского
и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении
Минздрава СССР.
1. Характеристика
анализируемых пестицидов
Линурон и
3,4-дихлоранилин (3,4-ДХА) представляют
собой белые
кристаллические
вещества, плохо растворимые
в воде (75
и 659 мг/л
соответственно)
и хорошо - в большинстве органических растворителей (низких
спиртах, ацетоне, ароматических углеводородах). Активное
вещество гербицида
линурона - N-(3,4-дихлорфенил)-N'-метокси-N'-метилмочевина. Температура
плавления линурона -
93 - 94°,
3,4-ДХА - 71
- 72° (1,2). Линурон
применяется как
гербицид избирательного действия для уничтожения однолетних
злаковых и двудольных сорняков на посевах кукурузы,
сои, картофеля, льна и
моркови. Линурон малотоксичен для
теплокровных (IV пр. г.к.). ЛД
для
50
белых мышей
и крыс -
2,17 - 2,40 г/кг. ДОК в картофеле
- 0,1 мг/кг; в
моркови наличие
остатков гербицидов не допускается.
Монолинурон представляет собой
белое кристаллическое вещество
с
температурой плавления
79 - 80°. Растворимость в воде - 580 мг/л при 20°,
хорошо растворяется
в этаноле, ацетоне,
бензоле и других органических
растворителях,
кроме предельных углеводородов. Активное
вещество
монолинурона
N-(4-хлорфенил)-N-метокси-N'-метилмочевина
(1,3). Химически
чистый 4-хлоранилин
(4-ХА) - белое кристаллическое вещество с температурой
плавления 70
- 71°. Монолинурон
применяется для уничтожения сорняков на
посадках
картофеля и льна-долгунца. Соединение
малотоксично
для
теплокровных: ЛД
для мышей и крыс - 2,0 -
2,5 г/кг. ДОК в клубнях
50
картофеля - 0,11
мг/кг.
Пропанид - белое
кристаллическое вещество, лишенное запаха,
с Т пл. 92
- 93
°С (технический продукт плавится
при 88 - 91 °С), мол. масса
218,08
(3). Растворимость
в воде - 225 мг/л (при 22 °С), в бензоле - 70 г/л; в
ацетоне - 1700
г/л. Хорошо растворим в хлороформе, изофороне
(60% при 25
°С), этаноле (54%
при 25 °С), бензине, петролейном и диэтиловом эфирах,
хорошо растворяется
в метаноле. Упругость паров - 0,008 мм рт. ст. при 40
°С, по другим
данным - 0,001
мм рт. ст. при 50 °С. Активное
вещество
пропанида - 3,4-дихлоранилид пропионовой кислоты.
Электронный спектр
поглощения спиртового раствора пропанида
характеризуется тремя максимумами
(лямбда ) в
ультрафиолетовой области - 247 - 250; 252,5 и 287,5; водного
макс
раствора - 248 нм.
Пропанид среднетоксичен для
теплокровных животных. ЛД для
крыс при
50
пероральном введении - 1384 +/- 100 мг/кг; по другим данным - 1300
- 2270
мг/кг, токсичная
концентрация для рыб - 10
мг/л. По некоторым данным
пропанид
обладает кумулятивным действием - коэффициент кумуляции 1,2 при
введении 1/50 ЛД .
50
Пропанид - высокоэффективный гербицид для избирательного уничтожения злаковых
просовидных сорняков на посевах риса. ДОК в рисе - 0,3 мг/кг.
Структурные формулы:
Cl N O CH
\___ | || /
3
Линурон C H N O Cl Cl-// \\-N-C-N
мол. масса 249,1.
9 10 2 2 2 \___/ \
--- OCH
3
N
O CH
___ | || /
3
Монолинурон C H N O Cl Cl-// \\-N-C-N
мол. масса 241,8.
9 11 2 2 \___/ \
--- OCH
3
Cl___
Пропанид C H ONCl Cl-//
\\NHCOC H мол.
масса 218,03.
9 9
2 \___/ 2 5
---
Cl___
3,4-дихлоранилин
C H NCl Cl-// \\NH
мол. масса 162,0.
6 5 2
\___/ 2
---
___
4-хлоранилин C H
NCl Cl-// \\NH
мол. масса 127,5.
6 6 \___/ 2
---
2. Принцип метода
Определение
пропанида,
линурона, монолинурона,
3,4-ДХА и 4-ХА в одной
пробе методом
хроматографии в тонком слое основано на извлечении соединений
смесью
органических растворителей, их упаривании, переэкстракции гербицидов
в н-гексан из
строго контролируемой кислой
среды и их упаривании (4).
о
Упаренный экстракт очищают на колонке с цеолитом 4А
(щелочная форма) (5) и
хроматографируют на пластинках Силуфол.
В качестве подвижных фаз используют бензол:ацетон (60:1,5) или н-гексан:диэтиловый эфир (1:2), в качестве азосоставляющей используют 1-нафтилэтилендиамин (6,7).
Полуколичественное определение производят путем визуального сравнения
интенсивности окраски и размера пятен пробы и стандартных растворов.
Чувствительность метода: для воды - 0,5 -
1,0 мкг/л, для почвы - 5 - 10 мкг/кг, для
растительного материала - 0,2 - 0,3 мг/кг. Ошибка определения +/- 5 - 10%.
3. Преимущество
метода
В
основу предлагаемого метода
положены
разработанные и
усовершенствованные элементы
анализа, пригодные как для метода ТСХ, так и
для количественного фотометрического определения.
Способ заключается в
очистке гексанового экстракта,
содержащего исследуемые соединения
на
о
колонке с
цеолитом 4А (щелочная
форма), что позволяет
количественно
разделять
гербициды и почвенные и растительные пигменты.
Преимущество
рассматриваемого метода, в отличие от известных, заключается в его экспрессности, хорошей воспроизводимости,
достаточно высокой чувствительности, возможности раздельного определения в
одной пробе гербицида и его основного метаболита.
4. Реактивы и
растворы
1. Едкий натр, чда,
10 н водный раствор (400 г NaOH растворяют, раствор
доливают водой до 1 л, перемешивают).
2. Серная кислота, хч, 50-процентный водный раствор (275 мл конц. H SO
2 4
уд. веса
1,84 осторожно вливают в 500 мл дистиллированной воды, охлаждают,
перемешивают).
3. Натрий сернокислый безводный, чда.
4. Бензол, хч.
5. Ацетон, хч.
6. н-Гексан, хч.
7. Диэтиловый
эфир, хч.
8. Хлороформ, чда.
9. Изопропиловый спирт, чда.
10. Проявляющие реактивы:
N 1 - к 20 мл конц.
HCl (d = 1,10) прибавляют 80 мл этилового спирта;
N 2 - 1 г азотистокислого
натрия растворяют в 2 мл воды и доводят до 100 мл этиловым спиртом;
N 3 - 1 г дигидрохлорида
1-нафтилэтилендиамина растворяют при нагревании на водяной бане в 2 мл воды и
доводят до 100 мл этиловым спиртом.
11. Стандартные растворы: 20 мг пропанида, линурона, монолинурона, 3,4-дихлоранилина и 4-хлоранилина растворяют
в 100 мл этилового спирта; концентрация этого раствора 200 мкг/мл.
5. Аппаратура и
оборудование
Роторный испаритель или выпаритель-концентратор.
Аппарат для встряхивания.
Камера для хроматографирования
- стеклянный цилиндрический или прямоугольный сосуд с притертой крышкой.
Пульверизаторы стеклянные.
Шприцы медицинские туберкулиновые
емкостью 1 мл.
Сито металлическое почвенное с диаметром
отверстий 0,1 - 1,0 мм.
6. Приготовление
сорбционной колонки
Стеклянную
хроматографическую колонку диаметром
15 мм, длиной 150 мм
заполняют стекловатой, имеющей
волокна 1 - 2 см (толщина слоя
0,3 - 0,5
мм). Далее колонку
на 4 -
5 см заполняют предварительно
измельченным
о
(фракция 0,1 -
0,5 мм) цеолитом 4А (щелочная форма).
7. Подготовка проб
к определению
Экстракция гербицидов
а) Из воды: анализируемый образец воды
(до 1 л) после отстаивания сливают в стакан, подщелачивают 20-процентным NaOH до рН 10, переносят в делительную воронку и
экстрагируют хлороформом (3 х 50 мл). Объединенный экстракт высушивают,
пропуская через безводный сернокислый натрий, и растворитель упаривают досуха.
б) Из сухой или влажной почвы и почвенной
суспензии: 100 - 500 г почвы или суспензии, освобожденной от растительных
остатков, заливают 100 - 300 мл ацетона, 3 - 5 мл 20-процентного NaOH, тщательно перемешивают палочкой, после чего
встряхивают в течение часа. Затем водно-ацетоновый экстракт фильтруют через
воронку Бюхнера, колбу ополаскивают ацетоном, почву
на фильтре промывают ацетоном (3 x 15 - 20 мл). Ацетон отгоняют на роторном
испарителе, водную часть экстракта подщелачивают 20-процентным NaOH до рН 10, переносят в делительную воронку и токсиканты экстрагируют хлороформом (3 х 20 - 30 мл).
Объединенный экстракт высушивают, пропуская через безводный сернокислый натрий,
и растворитель упаривают досуха.
в) Из растительного материала (водоросли,
корнеплоды моркови): 50 г измельченного материала (морковь, водоросли) заливают
150 мл смеси н-гексан:ацетон
(9:1), встряхивают в течение 1 ч и фильтруют. Остаток на фильтре трижды
промывают смесью растворителей (3 х 15 - 20 мл). Из объединенного экстракта
отгоняют органические растворители, жидкую фазу, оставшуюся после отгонки
растворителей, количественно переносят в делительную воронку. Колбу несколько
раз обмывают дистиллированной водой, сливая ее затем в воронку, и доводят общий
объем пробы до 100 мл. Приливают 18 мл 50-процентной серной кислоты,
экстрагируют гербициды хлороформом (3 х 10 мл), отгоняют органический растворитель и следы хлороформа удаляют током воздуха.
8. Экстракция
3,4-ДХА и 4-ХА
После экстракции гербицидов сернокислый
раствор (100 мл) нейтрализуют, подщелачивают до рН 10 (~ 30 мл 10 н NaOH) и экстрагируют 3,4-ДХА (4-ХА) хлороформом (3 х 20
мл), отгоняют органический растворитель и следы
хлороформа удаляют током воздуха.
9. Очистка
экстрактов, содержащих гербициды <*>
--------------------------------
<*> Очистку на колонке с сорбентом
проводят только для проб, содержащих пропанид, линурон и монолинурон, а пробы с
3,4-ДХА (4-ХА), полученные при раздельной экстракции, в очистке не нуждаются.
Сухие остатки в колбах, содержащих
гербициды, растворяют в 10 мл н-гексана и для
отделения пигментов раствор пропускают через колонку с цеолитом со скоростью 2
- 4 мл/мин. После подсушивания сорбента вакуумом соединения вымывают 50 мл
смеси растворителей н-гексан:диэтиловый
эфир (3:1), затем элюат упаривают досуха и далее
соединение анализируют.
9. Хроматографирование
Сухие
остатки, содержащие анализируемые
соединения, количественно
переносят диэтиловым эфиром
на пластинки Силуфол, пластинки
помещают в
камеру для хроматографирования;
подвижный растворитель - бензол:ацетон
(60:1,5). Край
пластинки погружают в
растворитель на глубину 5 - 7 мм.
Когда фронт
растворителя поднимается на
высоту 10 см,
пластинку
ополаскивают, вновь
заполняют смесью растворителей и производят повторное
хроматографирование.
Затем пластинки термостатируют при
160 °С: для
определения пропанида в
течение 40 мин.,
для определения линурона и
монолинурона - 5
мин. После этого
пластинки охлаждают и опрыскивают
последовательно проявляющими
реактивами N 1, 2,
3. При наличии в пробе
ароматических аминов,
пропанида,
линурона
и монолинурона появляются
фиолетовые пятна
на белом фоне.
R для 3,4-ДХА
- 0,64 +/- 0,02; для
f
линурона - 0,42 +/- 0,02; для монолинурона
- 0,26 +/- 0,02; для 4-ХА - 0,36
+/- 0,02; для пропанида - 0,25 +/- 0,02.
10. Обработка
результатов анализа
Содержание токсикантов
рассчитывают по формуле:
A
X = -,
B
где:
X - содержание препарата в пробе (мг/кг
или мг/л);
A - количество препарата, найденное путем
визуального сравнения размера и интенсивности окраски пятен пробы и стандартных
растворов, мкг;
B - навеска пробы (г) или объем аликвоты (мл).
Вместо термостатирования
можно облучать пластинки хроматоскопом типа БУФ-3 (расстояние от лампы 15 см,
экспозиция 10 мин.).