Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
28 января 1980 г. N 2132-80
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТИЛНИТРОФОСА И ФЕНИТРООКСОНА
В ЗЕРНЕ И ПРОДУКТАХ ПЕРЕРАБОТКИ ЗЕРНА ХРОМАТОЭНЗИМНЫМ
И ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Настоящие Методические указания
предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и
научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических,
контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других
министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и
биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и
рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по
химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при
МСХ СССР.
Методические указания согласованы и
одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы
ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского
и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении
Минздрава СССР.
1. Краткая
характеристика пестицидов
Метилнитрофос -
O,O-диметил-O-(3-метил-4-нитрофенил)-тиофосфат.
CH
S
____ 3
||
// \\
(CH O) P-O- NO C H O NPS
3
2 \____/ 2 9 12 5
---- Мол. масса 277,2.
Синонимы: метатион,
сумитион, фенитротион, фолитион, польвадофос, вататион, динатион, новотион, препарат 56600, Байер 41831, агратион-20.
Химически
чистый препарат -
светлая жидкость со слабым неприятным
запахом. Т
- 95 °С
при 0,01 мм рт. ст.; плотность 1,308; коэффициент
кип
-6
преломления 1,5505;
давление паров при 20 °С - 6 х
10 мм рт. ст.;
летучесть 0,82 мг/куб. м при 20 °С;
2,33 мг/куб. м при 30 °С; 6,11 мг/куб.
м при
40 °С. Растворимость
в воде около 30 мг/л, хорошо растворяется в
большинстве органических растворителей.
Препарат гидролизуется
в щелочной среде (в 0,1 н NaOH при 30 °С период полураспада 30 минут). При нагревании выше 100 °С изомеризуется и может
разлагаться со взрывом. Хранить препарат необходимо в эмалированной или
стеклянной таре, железо способствует разложению препарата. Выпускается в форме
30-процентного к.э. и 50-процентного к.э.
ПДК в воздухе рабочей зоны 0,1 мг/куб. м.
ДОК в полевых культурах утверждены 0,1 мг/кг. В настоящее время рекомендованы
ДОК в зерне 1 мг/кг, муке 0,3 мг/кг, хлебе 0,1 мг/кг. Применяется в качестве
контактного инсектицида и акарицида для борьбы с вредителями овощных,
технических, плодовых культур, обработки незагруженных зернохранилищ, рекомендован для обработки зерна.
Фенитрооксон - O,O-диметил-O-(3-метил-4-нитрофенил)-фосфат - токсический метаболит метилнитрофоса.
CH
O
____/ 3
|| //
\\ C
H O NP
(CH O) P-O- NO 9 12 6
3
2 \____/ 2 Относ. мол. масса 261,1.
В чистом виде - светлая жидкость со
слабым неприятным запахом.
2. Методика
определения метилнитрофоса и фенитрооксона
в зерне, муке, хлебе, отрубях хроматоэнзимным
и газохроматографическим методом
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Метод основан на извлечении метилнитрофоса (МНФ) и его токсического метаболита фенитрооксона из зерна, муки, хлеба, отрубей смесью
органических растворителей (н-гексан - диэтиловый эфир, 7:3), очистке охлажденным ацетоном и
параллельном определении их в аликвотных частях пробы методом газожидкостной
хроматографии и хроматографии в тонком слое с энзимным проявлением.
Газожидкостной хроматографией (ГЖХ)
определение проводится на
хроматографе
марки "Цвет" с термоионным детектором (ТИД) с использованием в
качестве неподвижной
фазы 5% SE-30 на хроматоне N-AW-ДМСS, газа-носителя -
азота. Этот
метод позволяет раздельно определять метилнитрофос
(t 3,8) и
уд.
фенитрооксон (t 3
минуты); чувствительность определения каждого -
0,001
уд.
мкг (т.е. 0,02
мг/кг при навеске муки, хлеба, отрубей 20 г). Количественное
определение
проводится по высоте пиков.
Определению фенитрооксона мешает
присутствие метафоса (t 3,16
мин.). Для идентификации
в этом случае
уд.
используется хроматоэнзимный
метод.
Тонкослойно-хроматографическое определение
с энзимным проявлением
(ТСХЭ) основано
на разделении соединений в тонком слое силикагеля КСК с
подвижной фазой
н-гексан
- ацетон 4:1 и обнаружении их по способности
угнетать холинэстеразу (ХЭ).
При этом идентификация их проводится как по
величинам R
(R МНФ 0,48; фенитрооксона
0,28), так и
по условиям
f
f
обработки. Так,
обнаружение фенитрооксона, являющегося
Р = 0
аналогом
метилнитрофоса,
может быть проведено
непосредственно после обработки
пластинки
субстратом, а для обнаружения
МНФ необходима предварительная
активация
пестицида на пластинке бромом. Этот метод
позволяет раздельно
определять МНФ
и фенитрооксон; чувствительность определения
МНФ без
активации 0,10 -
0,15 мкг, а с активацией бромом - 0,001 мкг (0,02 мг/кг);
чувствительность определения фенитрооксона
без активации 0,001 мкг
(0,02
мг/кг).
Определению метилнитрофоса мешает метафос
(R метафоса
0,47).
f
2.1.2. Метрологическая характеристика
метода:
- диапазон определяемых концентраций 0,5
- 50 мкг МНФ и фенитрооксона в анализируемой пробе;
- предел обнаружения МНФ и фенитрооксона 0,001 мкг (0,025 мг/кг);
- размах варьирования для МНФ и фенитрооксона 80 - 85% методом ГЖХ и 75 - 105% - методом
ТСХЭ;
- среднее значение определения
стандартных количеств МНФ и фенитрооксона 81% (ГЖХ) и
89% (ТСХЭ);
- стандартное отклонение при ГЖХ - 4,2%,
при ТСХЭ - 8,3%;
- относительное стандартное отклонение
при ГЖХ - 0,05, при ТСХЭ - 0,09;
- доверительный интервал среднего при р = 0,95 и n = 5 для МНФ и фенитрооксона
методом ГЖХ 81 +/- 4,9, методом ТСХЭ - 89 +/- 9,8%.
Сочетание указанных методов позволяет
идентифицировать метилнитрофос и фенитрооксон
в присутствии близкого к ним по химической структуре пестицида метафоса.
2.2. Реактивы и растворы
Основной стандартный раствор пестицидов (А)
- смесь стандартных растворов метилнитрофоса и фенитрооксона по 100 мкг/мл каждого (по 10 мг каждого
вещества растворяют в ацетоне в мерной колбе емкостью 100 мл).
Рабочие стандартные растворы готовят
разбавлением основного раствора "А".
Раствор "Б" - 0,5 мл раствора
"А" доводят в мерной колбе до 100 мл ацетоном (содержание каждого
вещества составляет 0,5 мкг/мл).
Раствор "В" - 5 мл раствора
"Б" доводят в мерной колбе до 25 мл (содержание каждого вещества 0,1
мкг/мл).
2.2.1. Для экстракции
н-Гексан, х.ч.
Диэтиловый эфир медицинский.
Ацетон, х.ч.
Фильтры бумажные (красная лента).
2.2.2. К методу ГЖХ
Стационарная фаза - метилсиликоновый
полимер SE-30 в количестве 5% на хроматоне N-AW-ДМСS,
100 - 120 меш.
Водород.
Азот особой чистоты (содержание O не должно превышать 0,003%).
2
Стекловата.
2.2.3. К методу ТСХ с энзимным
проявлением
Силикагель КСК, раздробленный и
просеянный через сито, 100 меш.
Кальций
сернокислый (CaSO х 2H O), прокаленный в течение 6 часов при
4 2
160 °С.
Бром.
Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ-711-57-69.
Калий железосинеродистый - 0,05 М раствор
(1,645 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды).
Калий железистосинеродистый
- 0,05 М раствор (2,110 г - в 100 мл H O).
2
Ортофосфорная кислота, х.ч.
Борная кислота, х.ч.
Уксусная кислота, ледяная.
Едкий натр, х.ч.
Буферный раствор pH = 8,69 - готовят раствор смеси ортофосфорной (2,1 мл),
уксусной (2,3 мл), борной (2,47 г) кислот и доводят дистиллированной водой до 1
л. Для получения буфера с pH = 8,69 к 100 мл
указанного раствора прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра, который
готовят растворением 0,800 г NaOH в дистиллированной
воде в мерной колбе емкостью 100 мл.
Ферментный препарат получают из печени
крупного рогатого скота (свежую, однократно замороженную и сохраняемую в
дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев). Для
приготовления ферментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл
буферного раствора и фильтруют через вату. К 1 мл полученной сыворотки
прибавляют 4 мл буферного раствора и используют этот раствор для опрыскивания
пластинок. Используют свежеприготовленный раствор.
Проявляющий реактив: 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл
дистиллированной воды (pH = 8,69), 2 мл раствора
железосинеродистого и 2 мл железистосинеродистого
калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед
опрыскиванием. На пластинку расходуется 3 - 4 мл смеси.
2.3. Приборы и посуда
2.3.1. Для экстракции
Колбы конические плоскодонные с пробками
емкостью 250 и 100 мл.
Воронки фильтровальные.
Ротационный испаритель с набором колб
емкостью 50 и 100 мл.
Пробирки мерные с пробками емкостью 5 -
10 мл.
2.3.2. Для ГЖХ
Хроматограф марки "Цвет" с
термоионным детектором.
Баллон с азотом особой чистоты.
Баллон с водородом.
Колонки стеклянные, длина - 1 м,
внутренний диаметр - 3 мм.
Микрошприц на 10 мкл.
2.3.3. Для ТСХЭ
Стеклянные пластинки размером 9 х 12 см.
Камера для хроматографирования.
Пульверизаторы стеклянные.
Камера для опрыскивания.
Компрессор или баллон с азотом или сжатым
воздухом для равномерного мелкодисперсного опрыскивания пластинок.
Пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл.
Мерные колбы емкостью 25 мл, 100 мл.
Микрошприцы на 10 мкл или микропипетки до 0,1 мл для
нанесения стандартных растворов и проб.
Термостат СШ-35 с температурой нагрева 37
- 40 °С.
Ступка керамическая.
Эксикатор.
2.4. Подготовка к определению
2.4.1. Подготовка колонок для ГЖХ
Используют готовую фазу SE-30 5% на хроматоне N-AW-ДМСS. Если нет готовой фазы, 0,7 г SE-30
растворяют в небольшом количестве хлористого метилена и приливают в круглодонную
колбу со шлифом, в которой находится 14 г носителя (хроматон
N-AW-ДМСS), залитого полностью тем же растворителем. Тщательно перемешивают всю
массу и выпаривают растворитель на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток
подсушивают в сушильном шкафу 4 часа при температуре 80 °С.
Приготовленный носитель хранят в склянке с притертой пробкой.
Для заполнения колонки один конец ее
закрывают стеклянной ватой, а в другой через воронку засыпают носитель.
Заполняют колонку постукиванием, закрывают второй конец тампоном из стеклянной
ваты.
2.4.2. Приготовление пластинок для ТСХЭ
Для приготовления 12 пластинок берут 35 г
силикагеля КСК, 2 г сернокислого кальция, приготовленного как
описано выше, и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель с гипсом
растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и размешивают до образования
однородной массы. 10 г суспензии наносят на пластинку и равномерно распределяют
по поверхности. Сушат пластинки строго в горизонтальном положении в течение 18
- 20 часов при комнатной температуре, хранят в эксикаторе.
2.5. Описание определения метилнитрофоса и фенитрооксона в
зерне, муке, отрубях, хлебе
2.5.1. Экстракция
Для проведения исследований отбирается
средняя проба зерна, муки, отрубей, хлеба весом 1 кг. Из каждой пробы (хлеб
измельчают) для анализа методом квартования
отбирается три навески по 20 г (из зерна по 50 г). Пробу заливают 50 мл смеси
н-гексан - диэтиловой эфир,
7:3, и оставляют на час, периодически встряхивая. Сливают растворитель через
фильтр, пробу заливают новой порцией экстрагента и
экстрагируют еще час. Объединяют обе порции экстракта, сушат безводным
сернокислым натрием в течение 15 мин. и переносят в прибор для отгонки
растворителей. Упаривают растворитель до объема ~ 1 мл под вакуумом на
ротационном испарителе при температуре бани не более 45 °С,
т.к. летучесть МНФ резко увеличивается с повышением температуры. Остатку
растворителя дают испариться на воздухе при комнатной температуре. Сухой
остаток смывают охлажденным при 0 °С ацетоном и,
фильтруя раствор через бумажный фильтр, переносят в мерную пробирку. Оставляют
на 15 мин., а затем доводят объем ацетона до 5 мл при комнатной температуре. Из
этой пробы проводят определение методом ГЖХ и ТСХЭ.
2.5.2. Метод аналитического определения
2.5.2.1. Газожидкостная хроматография
-10
Условия
хроматографирования. Шкала электрометра 2 х 10 А. Скорость
движения ленты
самописца 200 мм/час. Температура колонки 190 °С,
испарителя
- 220
°С. Расход газа: азота 22 - 24 мл/мин.; водорода 15 - 17
мл/мин.;
воздуха 24
л/час. Вводимый объем
2 - 5 мкл раствора. Линейность
детектирования
соблюдается для метилнитрофоса в пределах от 1 до 10 нг, для
фенитрооксона - от 0,5 до 6 нг.
Время удерживания препаратов: метилнитрофос 3,8 мин.; фенитрооксон
3 мин.; время удерживания по метафосу: метилнитрофоса 1,2; фенитрооксона
0,95.
Содержание препаратов в пробе вычисляют
по формуле:
C х V х H х 1000
X =
----------------,
V х H х
P
а
а
где:
X - содержание пестицида в пробе, мг/кг;
C - количество пестицида в стандарте, мкг;
V -
объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл;
а
V - общий объем экстракта (5 мл), мл;
H - высота пика пробы, мм;
H -
высота пика стандартного раствора, мм;
а
P - масса пробы, взятой для анализа, г.
2.5.2.2. Тонкослойная хроматография с
энзимным проявлением
С целью уменьшения краевого эффекта с хроматографической пластинки снимают с краев вдоль
направления движения подвижной фазы (со стороны 12 см) по 2 - 3 мм слоя
сорбента. Затем вдоль этой же стороны пластинку разделяют полосами на 4 равные
части. На 1-ю и 3-ю полосы на расстоянии 1,5 см от нижнего края наносят по 10 мкл стандартных растворов "Б" и "В",
т.е. по 0,001 мкг и 0,005 мкг действующих веществ, на 2-ю и 4-ю - 2 и 10 мкл соответственно пробы. Пластинку с нанесенными
растворами помещают в хроматографическую камеру, в
которую налита смесь н-гексан - ацетон, 4:1, за 30
мин. до хроматографирования.
Когда фронт растворителя
поднимется на 10 см, пластинку вынимают
из
камеры и
дают растворителю испариться.
Пластинку помещают на 1 мин. в
эксикатор, насыщенный
парами брома. Затем после
удаления избытка брома с
пластинки (~ 60
мин.) ее обрабатывают ферментным раствором и инкубируют в
течение 40 - 50
мин. в насыщенном водными парами термостате при
температуре
38 °С (для увлажнения в
сушильном шкафу ставят чашку Петри с водой). После
инкубации пластинки
опрыскивают проявляющим раствором
и помещают в
термостат при 38 °С. Метилнитрофос
и фенитрооксон проявляются в течение 10
- 30
мин. в виде
белых пятен на
голубом фоне, R
0,48 и 0,28
f
соответственно, чувствительность обнаружения каждого
0,001 мкг.
П-нитрокрезол этим методом не обнаруживается. Фенитрооксон может быть также
обнаружен указанным методом, если исключить стадию
активации; в этом случае
чувствительность
обнаружения метилнитрофоса на 4 порядка ниже.
Количественное определение проводят путем
сравнения площади пятна пробы с наиболее близкой к нему по величине площадью
стандарта. Пропорциональная зависимость площади пятна от концентрации
соблюдается в пределах от 0,001 мкг до 0,01 мкг. Содержание препарата в пробе
(мг/кг) рассчитывают по формуле:
а х S х V х 1000
2
X =
-----------------,
S х V х
P
1 1
где:
а - содержание препарата в стандарте, мкг;
S -
площадь пятна стандарта, кв. мм;
1
S -
площадь пятна пробы, кв. мм;
2
V -
объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкл;
1
V - общий объем экстракта, мл;
P - масса пробы, взятой для анализа, г.
2.6. Обработка результатов анализа
Обработка результатов анализа,
проведенного методом ГЖХ, приведена в п. 2.5.2.1, методом ТСХЭ - в п. 2.5.2.2.
2.7. Настоящие Методические указания
разработаны М.А. Клисенко, М.В. Письменной, ВНИИ
гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, г. Киев.
3. Требования
безопасности
Соблюдаются требования безопасности,
обычно рекомендуемые для работы с химическими реактивами.
4. Литература
Н.Н. Мельников. Химия и технология
пестицидов. Изд. "Химия", М., 1974, с. 518.