Утверждены

НТС Ростовского областного

Совета народных депутатов

 

РЕКОМЕНДАЦИИ

ПО ДИАГНОСТИКЕ И ПРОФИЛАКТИКЕ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА

(ВИБРИОЗА) КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

 

Утверждены НТС Ростовского областного Совета народных депутатов.

Одобрены ученым советом Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института.

В Рекомендациях отражены современные данные по диагностике и профилактике кампилобактериоза. Рассчитаны на широкий круг ветеринарных специалистов.

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Кампилобактериоз (вибриоз) - заразное заболевание крупного рогатого скота, характеризующееся воспалительными процессами в половых органах, проявляется абортами или бесплодием. К кампилобактериозу восприимчивы также зебу, буйволы и яки. Возбудителем болезни являются извитые микроорганизмы - плодовые кампилобактерии (Кампилобактер фетус субспекиес венериалис). Новое название болезни вместо вибриоза дано в связи с изменением названия возбудителя болезни.

Кампилобактериоз приносит большой экономический ущерб. По этой причине 20 - 40% коров остаются бесплодными, а 5 - 12% их абортирует.

В одном хозяйстве - колхозе им. Лукашина Мясниковского района Ростовской области - мы определили экономический ущерб из-за бесплодия коров на почве кампилобактериоза. При этом руководствовались "Рекомендациями по профилактике бесплодия и яловости крупного рогатого скота", изданными МСХ РСФСР в 1977 году.

При равных условиях кормления и содержания было осеменено 34 коровы (1-я группа) спермой больного кампилобактериозом быка-производителя. Столько же коров (2-я группа), содержавшихся в том же гурте, осеменилось спермой здорового быка. Качество спермы обоих быков было одинаковым. Подсчеты ущерба вели после отела всех коров обеих групп.

В первой группе количество дней бесплодия составило 9106, а во второй - 2118. Телят недополучено соответственно 28,9 (9106 : 315 - срок беременности плюс 30 дней послеродового периода) и 6,7.

За каждый день бесплодия корова недодала 5 кг молока, а недополученный теленок эквивалентен по стоимости 360 кг молока. С учетом этих показателей количество недополученного молока в первой группе составило 55994 кг, а во второй - 13002 кг.

Согласно прейскуранту сдаточная стоимость молока по указанному хозяйству при средней сортности равна 24,9 коп. за 1 кг. Следовательно, в денежном выражении убыток по первой группе коров составил 14042 руб. 50 коп., а по второй - 3237 руб. 50 коп. или меньше в 4,3 раза.

Для определения экономического ущерба из-за кампилобактериоза убыток, установленный в первой группе, уменьшили на сумму потерь из-за бесплодия во второй, здоровой группе коров. В итоге сумма его составила 10805 руб. (14042-50 - 3237-50). В пересчете на одну корову неблагополучной группы он равен 317 рублям.

 

ВОЗБУДИТЕЛЬ И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

 

Кампилобактерии представляют собой тонкие изогнутые палочки длиной 0,5 - 5 мкм и шириной 0,2 - 0,8 мкм. Они бывают в форме запятой, подковы или серпа, нередко имеют форму буквы S или напоминают контуры крыльев летящей чайки. Встречаются и спириллообразные бактерии, количество которых увеличивается в старых культурах. В них отмечаются также коккообразные формы бактерий.

Бактерии подвижны за счет жгутика, прикрепленного на одном или обоих полюсах клетки. Они не образуют спор и не имеют капсул. Сахаролитическими свойствами не обладают, восстанавливают нитраты в нитриты, желатин не гидролизуют, уреазоотрицательны, оксидазоположительны, микроаэрофилы.

Возбудитель кампилобактериоза при росте на питательных средах продуцирует фермент каталазу, не выделяет сероводорода, не восстанавливает селенит натрия в альбимиагаре, не растет на полужидком агаре (ПЖА) в присутствии 1% глицина (гликокола) и 3,5% хлористого натра, проявляет рост на той же среде с включением в нее от 2 до 10% бычьей желчи.

Кампилобактерии хорошо окрашиваются анилиновыми красками, грамотрицательны. Для окраски бактерий чаще используют карболовый фуксин, разведенный 1:5 дистиллированной водой. Они хорошо окрашиваются прижизненно оксалированным азурвиолетом. Для приготовления краски в 5 г этилового спирта растворяют по 0,1 г азур-эозина и кристаллического фиолетового, 0,5 г щавелево-кислого аммония, после чего добавляют 120 мл дистиллированной воды и доливают 180 мл физиологического раствора. Одну каплю такой краски смешивают на предметном стекле с каплей содержимого желудка плода или культуры и исследуют под микроскопом. Подвижность кампилобактерий можно наблюдать в темном поле микроскопа и при фазово-контрастной микроскопии. Добавление к капле такого же количества гомологичной типоспецифической сыворотки приостанавливает подвижность, что имеет дифференциальное значение.

Кроме патогенных кампилобактерий, от крупного рогатого скота, чаще из препуций быков выделяют непатогенный вид - Кампилобактер спуторум субенесиес бубулюс, а из желудочно-кишечного тракта - подвид кишечных кампилобактерий Камп. ф. с. ееуни. В отдельных случаях выделяются аэробные извитые бактерии, они непатогенны.

Сапрофитные бубулюсные кампилобактерии являются антагонистами плодовых кампилобактерий. В культуре они вызывают гибель возбудителя кампилобактериоза, но кишечные кампилобактерии не ингибируют его. В смешанных культурах устанавливают свойства, присущие обоим подвидам указанных бактерий.

Возбудитель кампилобактериоза гибнет в культуре при одновременном высеве синегнойной, кишечной и сенной палочек. Антагонистические отношения между возбудителем кампилобактериоза и другими бактериями затрудняют лабораторную диагностику болезни, но в то же время указывают на наличие таких антибиотических отношений в организме крупного рогатого скота, в частности в препуциальной полости быков-производителей. Мы ни разу не диагностировали кампилобактериоз у быков, инфицированных синегнойной палочкой или сапрофитными вибрионами. В опыте быки - носители сапрофитных вибрионов не заболели после заражения культурой возбудителя кампилобактериоза.

Антибиотические отношения между плодовыми кампилобактериями и другими видами бактерий могут быть использованы для профилактики кампилобактериоза. Так, например, нет никакой необходимости лечить быков - носителей сапрофитных кампилобактерий, такое носительство в свете приведенных данных имеет положительное значение.

Устойчивость возбудителя. Плодовые кампилобактерии сохраняются во внешней среде при плюсовых температурах до 30 суток, а в зимний период - значительно дольше. Они быстро гибнут при воздействии обычных дезинфекционных средств: 2-процентного раствора едкого натра, 2-процентной эмульсии креолина, 5-процентной взвеси хлорной извести.

В биологических объектах (печени, селезенке, головном мозге) возбудитель кампилобактериоза сохраняется при температуре 0 - 4 °С в течение семи дней и примерно столько же в содержимом желудка, но при более высокой температуре (16 - 20 °С).

Замораживание консервирует кампилобактерии. Мы их изолировали без изменения биологических свойств из спермы быков, хранившейся 5 месяцев при температуре минус 196 °С.

В культуре на ПЖА бактерии сохраняются до 20 - 30 дней, а при наслоении на культуру вазелинового масла - в течение нескольких месяцев. Высушивание способствует более длительному сохранению кампилобактерий. Для высушивания микробную массу смешивают в равных частях с защитной средой (аминопептид-2, 5-процентная желатоза с 10% сахарозы или 1,5-процентный желатин с 10% сахарозы), разливают по 1 мл в ампулы и после замораживания подвергают лиофилизации.

Патогенность. Плодовые кампилобактерии крупного рогатого скота не патогенны для лошадей, овец, коз, свиней и птиц. Беременные морские свинки, золотистые хомячки, белые мыши абортируют после подкожного или внутрибрюшного введения 0,2 - 0,5 мл микробной массы культуры кампилобактерий. Аборт наступает на 3 - 12-й день. Из органов абортированных плодов и матки абортировавших самок изолируют исходную культуру.

 

ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ

 

Источники инфекции. Ими являются больные вибриозом животные и клинически здоровые носители возбудителя болезни. Зараженные кампилобактериозом быки длительное время, если не пожизненно, представляют опасность как доноры инфекции. У зараженных коров возбудитель инфекции может находиться в половых органах 13 месяцев и более. Больные кампилобактериозом овцы не представляют опасности для крупного рогатого скота.

Пути заражения. По этому вопросу нет единого мнения. Как полагает большинство исследователей, заражение при кампилобактериозе происходит через половые пути. В то же время немало сообщений отечественных и иностранных исследователей о возможности заражения кампилобактериозом через пищеварительный тракт и при совместном содержании больных животных со здоровыми.

В связи с неясностью вопроса и его большим значением для практики мы поставили серию опытов по выяснению путей заражения при кампилобактериозе.

По результатам опытов, это заболевание является генитальным, с половым механизмом передачи. Возбудитель болезни локализуется в половых органах. Заражение происходит при случке или искусственном осеменении. Болеть могут только половозрелые животные. Алиментарное и контактное заражение не доказано.

Иммунитет. Переболевшие кампилобактериозом коровы и нетели повторно не болеют, иммунитет у них сохраняется в течение 4 - 5 лет. У быков иммунитет не вырабатывается. После освобождения от возбудителя болезни они могут заражаться повторно. У молодняка (бычков и телок) иммунитет также не вырабатывается из-за его ареактивности и быстрого освобождения организма от возбудителя инфекции.

 

ПАТОГЕНЕЗ И КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ

 

Возбудитель болезни локализуется в слизистой влагалища, канале шейки матки, матке, ее рогах и может быть обнаружен в яичниках. У быков он обитает преимущественно в препуциальной полости, но заселяет и уретру, придаточные половые железы, иногда придатки семенников. В некоторых случаях его обнаруживали в мочевом пузыре.

Кампилобактерии не проникают из половых органов в кровь, поэтому его не находят в других внутренних органах.

В месте локализации возбудителя возникает катаральное воспаление, причем преимущественно у половозрелых телок и коров, а у быков-производителей макроскопические признаки воспаления гениталий не обнаруживают.

Воспалительные процессы в гениталиях не препятствуют оплодотворению, но у оплодотворившихся животных наступает гибель зародыша в эмбриональный период или происходит аборт. Выкидышу предшествует развитие плаценты, вследствие чего возбудитель болезни проникает в плод и вызывает его гибель.

Половая локализация возбудителя инфекции определяет клинические признаки кампилобактериоза. При искусственном внутриполовом заражении взрослых животных не отмечается повышения температуры тела, не регистрируется этот признак и у естественно заболевшего скота.

Гематологическими исследованиями больных коров и телок в первые несколько недель после заражения не выявляется изменений в морфологическом и биохимическом составе крови, а также в лейкоцитарной формуле. В кровь возбудитель болезни не проникает.

Через одну - три недели после заражения у животных обнаруживаются выделения из влагалища в виде мутной слизи с примесью крови, а на слизистой наблюдаются полосчатые или точечные кровоизлияния и мелкопузырчатая сыпь. Подобные изменения не выявляются у коров и телок, оплодотворившихся в первую охоту, но затем абортировавших.

Аборт - главный клинический признак болезни. Он происходит по большей части плодами 4 - 6-месячного возраста. Количество выкидышей достигает 11% при вольной случке и 4% при осеменении искусственно.

Абортированные плоды нередко отечны, в грудной и брюшной полостях - выпот кровянистой жидкости. Содержимое желудка мутное, однако этот признак не имеет большого диагностического значения, он не всегда коррелирует с обнаружением возбудителя болезни.

В хозяйствах с неудовлетворительным кормлением коров отмечают задержание последа, притом чаще при прерывании стельности в 6 - 8-месячном возрасте.

Повторные аборты на почве кампилобактериоза не установлены. Не регистрировалась и гибель новорожденных телят от этого заболевания.

Важным клиническим признаком болезни являются многократные повторные осеменения. Они чаще наблюдаются в летне-осенние месяцы, в то время, как аборты - в осенне-зимнее время. Такое сезонное проявление болезни связано с массовым осеменением коров после выхода их весной на пастбища, когда они чаще всего заражаются кампилобактериозом.

При кампилобактериозе отмечают удлинение срока полового покоя (диэстоуса) между половыми циклами. Такое изменение сроков проявления последующего цикла называется аритмией полового цикла. Оно имеет диагностическое значение. Для примера приводим данные, собранные в двух неблагополучных по кампилобактериозу хозяйствах Ростовской области: колхозе им. Лукашина Мясниковского и совхозе "Советская Россия" Аксайского районов.

У 100 здоровых коров, осемененных спермой здоровых производителей, период между первой и второй охотой составил 39,0 дней, между второй и третьей - 45,3, а между третьей и четвертой - 67,5 дня. Все коровы оказались стельными, в том числе после первого осеменения - 48.

В группе 117 больных коров период между первой и второй охотой был равен 54,5, между второй и третьей - 86,2 и между третьей и четвертой - 67,3 дня. Как видно, особенно значительным он был между второй и третьей охотой, превышая аналогичные данные по здоровым коровам почти в 2 раза.

Такое значительное удлинение срока между второй и третьей охотой указывает на прервавшуюся беременность и рассасывание зародыша, а затем и желтого тела. Период между последующими половыми циклами у больных животных сокращался, вероятно, уменьшались и случаи гибели зародышей. В одном опыте было убито девять телок, многократно перегулявших, а затем вновь слученных с больными быками-производителями за 10 - 45 дней до убоя. В матке четырех телок обнаружены зиготы, еще у четырех - эмбрионы 20 - 30- дневного возраста и у одной - 1,5-месячный плод. Из половых органов восьми телок мы изолировали культуру возбудителя болезни. Несмотря на это, оплодотворение произошло и не погиб ни один зародыш. Гибель их (эмбриональная смертность), надо полагать, имела место после предыдущих оплодотворений.

В указанных двух хозяйствах определили результативность осеменения животных в первую охоту. Из числа абортировавших в этот срок оплодотворились 14 (35%), из группы длительно бесплодных - 12 (28,5%) и в группе здоровых - 48 (48%). Индекс оплодотворяемости (количество осеменений на одно оплодотворение) составил по больным коровам 3,4, а по здоровым 1,6.

Продолжительность бесплодия у абортировавших коров от первого оплодотворения до второго (после аборта) равна в среднем 10 месяцам, в группе длительно бесплодных - 379 и в группе стельных, оплодотворившихся после многократных перегулов, - 175 дням, а по всем группам - 285 дням. Среди здоровых коров, осемененных спермой здоровых быков, срок бесплодия исчисляется 62 днями.

 

ДИАГНОСТИКА

 

Диагноз ставят по клинико-эпизоотологическим данным и результатам лабораторного исследования патологического материала. Во всех случаях для установления диагноза требуется выделение культуры возбудителя болезни. Надо иметь в виду, что высеваемость кампилобактерий невысокая.

Мы подсчитали, что для выделения одного штамма возбудителя кампилобактериоза от больных быков, находившихся в хозяйствах, потребовалось в среднем три исследования. Несколько лучшие результаты получали при исследовании абортированных плодов коров, доставленных в лабораторию института.

Приведенные данные указывают на необходимость повторных исследований патологического материала. От быков-производителей он должен проверяться не менее трех раз, а из хозяйств исследоваться не менее трех плодов.

Для подтверждения диагноза, установления степени распространения болезни и с целью ее дифференциации от других заболеваний используют серологический метод - реакцию агглютинации с влагалищной слизью (РАВС).

 

Бактериологическая диагностика

 

Для исследования в лабораторию направляют:

а) сперму, препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез быков;

б) абортированные плоды или их внутренние органы;

в) плаценту, цервикальную слизь от абортировавших коров в первые 3 - 4 дня после аборта или цервикальную слизь коров в период охоты;

г) половые органы, мочевой пузырь, лимфоузлы тазовой полости от убитых животных.

Сперму получают обычным способом. Ее высевают на месте или переносят в стеклянный флакон, закрывают полиэтиленовой пробкой, помещают в термос со льдом и направляют в лабораторию.

Материал из препуция получают приборами Г.К. Корчака, Р.В. Казеева, Я.А. Крылова и другими. От быков ремонтных и используемых в вольной случке, кроме препуциальной слизи, берут секрет семенных пузырьков, для чего их массируют рукой через прямую кишку.

Абортированные плоды, плацента и органы животных пригодны для исследования в первые 10 - 12 часов после аборта или убоя животных. В летний период этот материал транспортируют в таре со льдом, а зимой его направляют в замороженном виде.

Цервикальную слизь берут с помощью прибора НИСП-1 Р.В. Казеева полистероловой пипеткой, соединенной со шприцом (Н.Н. Михайлов, М.А Лучко), или прибором, описанным П.А. Триленко.

Полученный материал сразу высевают на питательные среды. Лучшей средой является 0,2-процентный полужидкий агар, приготовленный на экстракте из мышц сердца крупного рогатого скота или пептоне Мартена. Кампилобактерии хорошо растут на среде Китт-Тароцци без масла, среде Эдварда. Для культивирования загрязненного материала в среды добавляют перед автоклавированием 1:30000 бриллиантового зеленого и 10% желчи.

На плотных средах кампилобактерии растут скудно. Для улучшения роста в них требуется добавлять 5 - 10% дефибринированной крови или сыворотки, аминопептид-2, 20% обезжиренного молока, экстракт сухих дрожжей (5 г на 1 л среды). А.В. Голиков, В.В. Концевенко, Д.С. Лодьянова рекомендуют культивировать кампилобактерии на сафранино-железо-новобиомициновой среде (СЖН). При ее приготовлении к 9,85 мл ПЖА добавляют по 5 мл 2-процентного раствора сернокислого железа, 0,5-процентного раствора сафранина-Т и 0,2-процентного раствора новобиомицина, приготовленных на дистиллированной воде. Среду тщательно смешивают, разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют при 0,8 атм. в течение 25 минут. Содержавшиеся в среде сафранин и новобиомицин не действуют губительно на кампилобактерии, но сдерживают развитие посторонних бактерий.

Те же препараты включены как ингибиторы банальной микрофлоры в твердую среду - сердечно-мозговую кровяную сафранино-новобиомициновую (А.В. Голиков, А.С. Вовк и В.В. Полупанова, "Ветеринария", 1980, N 6, с. 69).

В нашей лаборатории выяснено, что отвар печени, включаемый в ПЖА, отрицательно влияет на рост кампилобактерий. Приготовление полужидкой среды на отваре семенников быка способствовало более интенсивному их росту, а при добавлении в среду кусочков тестес быка они росли первоначально вокруг них и лишь потом поднимались над поверхностью среды. Сапрофитные кампилобактерии, в отличие от плодовых, не росли около кусочков тестес. Включение в среду по 40 ЕД/мл новобиоцина дало возможность широко использовать ее для исследования на кампилобактериоз загрязненного материала, прежде всего спермы и препуциальной слизи от быков.

При исследовании спермы, слизи, секрета придаточных желез набранный в пипетку материал подсасывают до расширенной части пипетки, конец ее обжигают и спускают в пробирку с полужидкой средой до дна, набирают среду, чтобы она соединилась с материалом, и осторожно выдувают. Затем пипетку слегка поднимают, отводят к стенке пробирки, набирают среду до расширенной части пипетки и переносят в следующую пробирку. При таком способе посева столбик среды не обсеменяется микрофлорой и чаще можно получить чистую культуру кампилобактерий.

Эта же цель достигается, если в пробирки с ПЖА вставляют перед автоклавированием семисантиметровые стеклянные трубки. Исследуемый материал наносят на среду, заключенную в трубке. Кампилобактерии, размножаясь, проникают до дна пробирки, а затем поднимаются по незасеянной части среды к ее поверхности.

Загрязненный материал (сперму, слизь) можно культивировать в пастеровских пипетках с ПЖА или другой полужидкой средой. Их набирают в количестве 1 - 1,5 мл, а затем осторожно подсасывают исследуемый материал до расширенной части пипетки. Ей придают горизонтальное положение, конец запаивают на горелке и ставят в пробирку, на дне которой имеется кусочек ваты.

Высеваемость кампилобактерий повышается, если материал предварительно центрифугировать в течение 10 минут при 1000 об./мин. и высевать надосадочную жидкость.

Хорошо зарекомендовала себя фильтрация материала через мембранные фильтры N 5 - N 2 - N 5. Фильтрация производится с помощью фильтра Зейтца и насоса Комовского или прибора, предложенного Я.А. Крыловым. Для накопления кампилобактерий в смешанную культуру на ПЖА наслаивают 4 - 5 мл бульона Хоттингера, пробирки помещают в термостат на 4 - 6 часов. За это время кампилобактерии переходят в бульон. Его отсасывают пипеткой и фильтруют. Фильтрат в объеме 0,5 - 1 мл высевают в ПЖА, культивирование производят в условиях микроаэробиоза.

Сперму и препуциальную слизь высевают на 5 пробирок ПЖА, ПЖА с бриллиантовым зеленым и желчью, СЖН или другие среды, а материал от абортированных плодов и органов убитых животных - на 3 - 5 пробирок из каждого органа. Во всех случаях высевают по 0,3 - 0,5 мл материала.

Если доставлен послед, его обмывают водопроводной водой, вырезают 2 - 3 кусочка плаценты, опускают их на 2 - 3 секунды в кипящую воду, затем переносят в стерильную ступку и растирают с песком, добавляют 3 - 5 мл физиологического раствора и производят посев.

Посевы культивируют в эксикаторах или микроанаэростатах в условиях замены 10 - 15% воздуха двуокисью углерода. Ее получают с помощью аппарата Киппа за счет распада мрамора под действием 10-процентной соляной кислоты. Имеются сообщения о лучшем росте при газовом составе, включающем 5% кислорода, 10% двуокиси углерода и 85% азота. Оптимальная температура для культивирования возбудителя кампилобактериоза 37 - 38°.

Посевы просматривают в течение 10 дней, начиная с третьего дня.

Кампилобактерии растут на ПЖА в виде серовато-голубого диска, на плотных средах отдельными серо-голубыми колониями или мелкоросинчатым голубоватым налетом.

Методы очистки загрязненных культур. Культуры вибрионов часто загрязнены банальной микрофлорой. Если бактерии неподвижны (кокки), культуру пересевают в пастеровские пипетки, которые заполняют ПЖА, этой средой с бриллиантовым зеленым и желчью, а также СЖН. Вместо пастеровских пипеток можно использовать пробирки с ПЖА и семисантиметровыми стеклянными трубками, которые вставляют перед автоклавированием среды. Посев производят на среду, заключенную в трубке.

При наличии в культуре подвижной микрофлоры ее фильтруют через мембранный фильтр. Фильтратом засевают 4 - 6 пробирок с полужидким агаром.

Применяют также биологические методы очистки культур. С этой целью вводят внутрибрюшинно морским свинкам 0,5 - 1,0 мл или белым мышам 0,3 - 0,5 мл культуры. Через 10 минут животных убивают и производят посев из органов на питательные среды. Этот метод не всегда дает ожидаемый результат. Более эффективна очистка смешанных культур через самок белых мышей при введении их в вагину опаянной пастеровской пипеткой в дозе 0,1 мл. Введение культуры повторяют на второй день. Через 6 - 7 дней мышей убивают, вскрывают, вырезают стерильными ножницами кусочки рогов матки и опускают в ПЖА.

Рост культур проверяют на 3-й, 6-й и 9-й дни термостатирования.

 

Бактериологическая дифференциация кампилобактерий

 

Ее осуществляют по культурально-биохимическим свойствам бактерий. Выделенные чистые культуры бактерий подвергаются идентификации по признакам, определяющим род Кампилобактер, и дифференцируются до вида (подвида) и варианта <1>.

--------------------------------

<1> Термин "дифференциация" предпочтительнее термина "типизация". По проекту Международного кодекса номенклатуры бактерий вместо "типа" (типизация) рекомендуется употреблять термин "варианта".

 

По большинству исследователей, возбудитель кампилобактериоза крупного рогатого скота относится к одному серологическому варианту, в то время, как внутри интенстинальных штаммов серологические различия несколько шире и они особенно значительны среди кишечных кампилобактерий. Так, например, мы исследовали 137 таких штаммов, выделенных от крупного рогатого скота, овец и свиней из хозяйств Северного Кавказа. Из них 45 (32,8%) штаммов отнесены к I серовару, 65 (47,5%) - ко II, 10 (7,3%) обладали свойствами обоих сероваров, а 17 (12,4%) не агглютинировались ни одной из биофабричных вариантоспецифических сывороток. По биохимическим свойствам все эти штаммы относились ко II биовару.

Роль кишечных кампилобактерий в патологии беременности, как уже отмечалось, незначительна. В связи с этим практическое значение имеет точная идентификация венериальных и интенстинальных штаммов, изолируемых из абортированных плодов коров, овец и половых органов этих видов животных. Оба подвида плодовых кампилобактерий следует дифференцировать от непатогенных кампилобактерий: кишечных, аэробных и бубулюс.

Для дифференциации пригодны только чистые культуры бактерий. Их проверяют на каталазную активность, сероводородообразование, выясняют рост на ПЖА в присутствии 1% глицина (гликокола), 3,5% хлористого натра, 10% желчи.

Пробу на каталазу ставят с трехсуточной культурой, в нее добавляют равное количество 3-процентной перекиси водорода (I часть пергидроля + 9 частей дистиллированной воды), пробирку закрывают резиновой пробкой и несколько раз переворачивают. В положительных случаях в течение первых двух - пяти минут образуется столбик пены высотой 5 мм и более.

Активность штамма зависит от ряда условий и, прежде всего, от состава питательной среды. Отмечено, что усилители роста, добавляемые в среды, увеличивали активность каталазы, а ингибиторы кампилобактерий понижали ее. В связи с этим проба на каталазу может быть дополнительным тестом для определения качества сред, их питательного достоинства. Добавление в среду кусочков органов, сердца, матки, тестес увеличивало каталазную активность культур венериальных штаммов, в то время как другие органы не обладали этим свойством.

Каталазная активность связана с размножением кампилобактерий, она начинает увеличиваться после 12-часовою термостатирования, а максимальной величины достигает по истечении 10 суток.

Сероводород определяют с помощью фильтровальной бумаги, пропитанной насыщенным раствором основного уксуснокислого свинца. Полоски бумаги помещают в пробирки с засеянной культурой на ПЖА и ПЖА с 0,02% цистеина на 1 - 1,5 см от поверхности среды. Результат учитывают ежедневно и течение 5 суток термостатирования. Почернение кончика бумаги - положительная реакция.

Венериальные штаммы кампилобактерий не выделяют сероводорода, интестинальные бывают нередко положительными по этому тесту, а сапрофитные кампилобактерии (бубулюс) - активные сероводородообразователи.

    Реакция  на  сероводород  основана  на  способности  определенных видов

бактерий  использовать  для  питания  аминокислоту - цистеин. Если бактерии

содержат   фермент   цистеиназу,   то   происходит   расщепление   молекулы

серосодержащей аминокислоты цистеина с выделением H S.

                                                   2

Выделяющийся сероводород можно определить на специальной среде (Балчев). Она готовится из мясной воды - 250 мл, пептона - 15 г, цистина - 0,22 г, натрия хлористого - 32 г, натрия серноватистокислого (тиосульфита) - 1 г, железа лимонно-аммиачного - 1 г, агар-агара - 1 г, фенолового красного - 0,005 г, дистиллированной воды - до 1000 мл. Среду разливают в пробирки по 6 мл и стерилизуют (pH 7,2 - 7,4).

    Если   проверяемая   культура   выделяет   H S,   то   среда   чернеет;

                                                2

сероводородоотрицательные штаммы среду не изменяют.

Возбудитель кампилобактериоза крупного рогатого скота не растет на ПЖА с 3,5% хлористого натра, в то время, как сапрофитные бактерии растут. Он не проявляет роста и в присутствии 1% глицина, но размножается в среде с 4 или 10% бычьей желчи.

В отдельных случаях для дифференциации кампилобактерий могут быть использованы такие тесты, как редукция 0,2-процентного селенита натрия, нитратов, а также особенности роста на среде с 0,5-процентным агар-агаром, 8% глюкозы, на плотной среде в аэробных условиях и при 25 °С.

 

Серологическая дифференциация кампилобактерий

 

С этой целью применяют РА с вариантоспецифическими сыворотками и антигеном из исследуемой культуры. Выделенный штамм пересевают три раза на ПЖА с 10% аминопептида-2 для адаптации к питательной среде, а затем на плотную среду, которая отличается от ПЖА лишь большим количеством агар-агара (2 - 3%). Эту среду после стерилизации охлаждают до 65 - 70°, после чего к ней добавляют 20% стерильного обезжиренного молока или 10% аминопептида-2, или 10% дефибринированной стерильно взятой крови от крупного рогатого скота или барана.

Культуру штамма пересевают по 0,3 - 0,5 мл на 4 - 5 чашек с плотной средой, ставят их в эксикатор, добавляют в него 20% двуокиси углерода и производят термостатирование в течение 2 - 3 суток. Культуру проверяют на чистоту. Незагрязненный рост смывают физиологическим раствором с 0,3% формалина, дважды промывают его тем же раствором на центрифуге при 3000 об./мин., а затем доводят до 1 млрд. концентрации МК и используют в РА с тремя вариантоспецифическими и нормальной сыворотками кролика.

Реакцию ставят в пробирках в объеме 1 мл. Каждую из трех сывороток разводят формалинизированным 3-процентным раствором хлористого натра 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200. Затем в каждое разведение сыворотки добавляют равное количество (0,5 мл) проверяемого антигена.

Контроли: стандартный антиген плюс формалинизированный 3-процентный раствор поваренной соли; проверяемый антиген с тем же раствором; нормальная сыворотка кролика в разведениях с 1:25 до 1:200 плюс проверяемый антиген.

Пробирки опыта и контроля встряхивают, ставят на сутки в термостат при 37°, а затем выдерживают 3 - 4 часа при комнатной температуре и учитывают реакцию. Ее оценивают по степени просветления столбика жидкости и образования рыхлого осадка. В случаях полного просветления столбика жидкости и образования рыхлого осадка реакцию признают положительной, а если просветление неполное и имеется осадок, реакцию считают сомнительной. Отрицательная реакция - отсутствие феномена агглютинации. Аналогичная картина должна быть во всех пробирках с разведениями нормальной сыворотки кролика и стандартным антигеном, а также со стандартным антигеном, проверяемым антигеном и 3-процентным формалинизированным раствором хлористого натра.

Штамм относят к тому варианту, с сывороткой которого получена полная агглютинация антигена. Если же две сыворотки агглютинировали антиген в одинаковом разведении, то реакцию повторяют до установления предельного титра и по нему судят о серологической принадлежности штамма.

При постановке реакции можно пользоваться живым антигеном. Исследуемую культуру выращивают на ПЖА или среде Тароцци без масла, а затем переносят по 0,5 мл в четыре пробирки бульона Хоттингера. Через двое суток роста в первую пробирку вносят 0,1 мл (две капли) сыворотки 1-го серовара, а во вторую и третью - сыворотку 2-го и 3-го сероваров. Четвертая пробирка - контроль. Пробирки встряхивают и выдерживают сутки в термостате. В положительном случае происходит просветление культуры с образованием на дне рыхлого осадка. Если культура агглютинирована двумя сыворотками, реакцию ставят по вышеописанному классическому методу.

 

Флуоресцентная микроскопия при кампилобактериозе

 

Она применяется для обнаружения кампилобактерий в патологическом материале и смешанных культурах, дифференциации патогенных кампилобактерий от непатогенных. Этим методом нельзя дифференцировать возбудителя кампилобактериоза крупного рогатого скота от возбудителя кампилобактериоза овец.

Микроскопию проводят согласно наставлению от 18.11.1968.

 

Серологическая диагностика кампилобактериоза

 

В СССР узаконена РА с влагалищной слизью коров и телок (РАВС). Она основана на обнаружении в слизи агглютининов с помощью кампилобактериозного антигена. Агглютинины появляются в слизи через 1,5 - 4 месяца с начала заражения. У абортировавших на почве кампилобактериоза коров их обнаруживают в первые дни после аборта.

Слизь берут на марлевый тампон. Его готовят из бинта длиной 10 - 12 см, сворачивают до размера сливы, перевязывают ниткой, а затем ее наматывают на тампон и помещают в пробирку, конец нитки фиксируют пробкой. Тампоны стерилизуют в автоклаве.

Перед взятием слизи производят туалет наружных половых органов. Извлеченный за нитку тампон зажимают корнцангом с длинными бранщами и вводят во влагалище на 20 - 25 см до упора в свод. Корнцанг разжимают и извлекают, нитку обрезают, оставляя конец длиной 5 - 7 см. Необходимо иметь несколько корнцангов, использовать их после кипячения.

По истечении 45 - 60 минут тампон удаляют, помещают в пробирку, этикируют и отправляют в лабораторию. В пробирки добавляют по 5 мл 3-процентного хлористого натрия с 0,3% формалина, ставят до утра следующего дня в холодильник для экстрагирования слизи. При хранении в холодильнике пробы пригодны для реакции в течение 7 суток.

Перед реакцией тампоны со слизью отжимают и выбрасывают. В необходимых случаях экстракт слизи фильтруют через бумажный фильтр или центрифугируют в течение 20 - 30 минут при 3000 об./мин.

Реакцию ставят в четырех разведениях в объеме 1 мл. Во вторую, третью, четвертую пробирки наливают 3-процентный раствор хлористого натрия с 0,3% формалина. Экстракт слизи разливают в первую и вторую пробирки по 0,5 мл. Содержимое второй пробирки перемешивают и 0,5 мл переносят в третью пробирку, из третьей - в четвертую, а из нее 0,5 мл смеси удаляют.

Во все четыре пробирки вносят по 0,5 мл стандартного кампилобактериального антигена с 1 млрд. концентрацией микробных клеток.

Контроли к реакции:

1. На самоагглютинацию. К 0,5 мл антигена добавляют 0,5 мл формалинизированного 3-процентного раствора поваренной соли.

2. На активность. В каждое разведение типоспецифической сыворотки от 1:50 до 1:400 добавляют 0,5 мл испытуемого антигена.

3. На специфичность. В разведения нормальной сыворотки кролика 1:100 и 1:200 вносят по 0,5 мл того же антигена.

Пробирки опыта и контроля встряхивают и ставят на сутки в термостат, а затем выдерживают при комнатной температуре в течение 3 - 4 часов. Учет реакции начинают с контролей. При правильном ходе реакции контроли 1 и 3 должны быть отрицательными, а второй - положительным. После этого учитывают ход реакций в опыте.

Положительная реакция: ++++ или +++ (4 или 3 креста) - полное просветление жидкости во всех пробирках или только в первой и второй и неполное просветление в третьей и четвертой пробирках. На дне образуется рыхлый осадок, который при встряхивании разбивается в мелкие хлопья.

Сомнительная реакция: ++ или + (2 или 1 крест) - неполное просветление жидкости в первой и второй пробирках, небольшое количество осадка на дне их.

Отрицательная реакция (-) - феномен агглютинации отсутствует во всех четырех пробирках.

Реакция агглютинации с сывороткой крови и молока не применяется для диагностики кампилобактериоза.

Положительная РАВС подтверждает наличие кампилобактериоза в стаде, но по ней нельзя ставить диагноз на это заболевание. Для этого нужно выделить культуру возбудителя болезни.

 

МЕРОПРИЯТИЯ ПО ОЗДОРОВЛЕНИЮ ПРИ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗЕ

 

Основу борьбы и предупреждения заболевания составляет комплекс организационно-хозяйственных, зоогигиенических, ветеринарно-санитарных и лечебно-профилактических мероприятий, предусмотренных Инструкцией от 5 марта 1971 года.

Животных содержат в благоустроенных помещениях, летом - на пастбище. Отел коров проводят в родильных отделениях. Молодняк выращивают обособленно от взрослых животных.

Следует избегать доукомплектования стад из хозяйств с неизвестной по кампилобактериозу эпизоотологической ситуацией. Особо важное значение имеет пополнение стад быков-производителей племенных предприятий. Быков приобретают только в благополучных хозяйствах, перед выводом их проверяют три раза на кампилобактериоз с промежутком в 10 дней. За месяц до исследования полость препуция бактерицидными средствами не обрабатывают.

Приобретенных животных карантинируют в течение месяца, а купленных в иностранных государствах - в течение двух месяцев. В период карантина быков исследуют так же, как перед продажей. Контрольные проверки быков племпредприятий осуществляют один раз в шесть месяцев.

При установлении диагноза на кампилобактериоз решением райсовета народных депутатов на неблагополучные хозяйства, племпредприятия накладывают ограничения.

Больных животных изолируют и лечат. Выясняют источники инфекции. С этой целью определяют индекс оплодотворяемости у быков, сперма которых использовалась в хозяйстве, удаляют из стада всех быков, включая пробников. Учитывают количество абортов, мертворождений и случаев многократного осеменения и нарушенного полового цикла.

Усиливают ветеринарно-санитарные мероприятия. Последы сжигают или сбрасывают в яму Беккари. Стойло, где произошел аборт, и соседние подвергают очистке и дезинфекции любыми дезсредствами, имеющимися в хозяйстве.

Хозяйство (ферму, гурт) объявляют благополучными по кампилобактериозу крупного рогатого скота при отсутствии в течение 12 месяцев абортов на почве этого заболевания, получении отрицательных результатов исследования влагалищной слизи абортировавших и бесплодных коров и проведении комплекса ветеринарно-санитарных мероприятий.

На неблагополучных по кампилобактериозу племпредприятиях прекращают взятие спермы от быков-производителей. Их разбивают на две группы. Первая группа - быки, от которых выделена культура возбудителя кампилобактериоза, и животные, сперма которых использовалась в хозяйствах, где регистрировались аборты кампилобактериозной этиологии. Во вторую группу включают всех остальных быков, подозрительных по заражению.

Быков первой группы изолируют и подвергают лечению. Им инъекцируют внутримышечно пенициллин и стрептомицин по 4 тыс. ЕД/кг. Препараты вводят четыре дня подряд два раза в сутки, растворяют их в 0,5-процентном растворе новокаина. Через 5 - 6 дней курс лечения повторяют. Быков, подозреваемых в заражении кампилобактериозом, подвергают однократному курсу лечения пенициллином и стрептомицином. Так же лечат и животных, если от них выделены интестинальные штаммы кампилобактерий.

При первом курсе лечения быкам ежедневно в течение четырех дней вводят в препуциальную полость по 1 млн. ЕД пенициллина и стрептомицина в 50 - 60 мл растительного масла. Препуциальная полость предварительно промывается 3-процентной перекисью водорода или раствором фурациллина 1:5000. После введения антибиотиков на край препуциального мешка накладывается резиновое кольцо и препуций массируют в течение 2 - 3 минут. Такую манипуляцию повторяют 5 - 6 раз через 3 - 5-минутные интервалы. В период второго курса лечения вместо антибиотиков в препуциальную полость вводят 5-процентную взвесь фуразолидона на растительном масле.

По изложенной методике, предусмотренной инструкцией, лечились семь больных быков Ростовского головного племпредприятия, выздоровели лишь пять. Лечение трудоемко, к тому же оно дорого. В связи с этим в нашей лаборатории изыскивались другие, более совершенные, методы лечения кампилобактериоза. Был разработан метод, при котором лекарственные средства действовали длительное время. С этой целью для общего лечения использовали бициллин-5. Бактерицидная активность препарата в опытах in vitro составляла 0,3 ЕД/мл среды. В пределах этой концентрации он циркулировал в крови животных свыше 20 дней.

Для обработки препуциальной полости использовали дибиомицин. Введенный в препуциальную полость, он сохранялся до семи суток.

Указанными пролонгированными антибиотиками лечили шесть больных кампилобактериозом быков-производителей. Четырех быков не лечили, они служили контролем.

Бициллин-5 вводили внутримышечно один раз в виде взвеси на дистиллированной воде из расчета 20 тыс. ЕД/кг массы животных. Местное лечение начинали с обработки кожи вокруг препуциального кольца теплой водой с мылом, а затем препуциальный мешок промывали 3-процентным раствором перекиси водорода. После этого с помощью шприца Жанэ вводили 2 г дибиомицина в 30 мл вазелинового масла и одновременно вдували 200 куб. см воздуха. На край препуция накладывали резиновое кольцо, в течение 3 - 5 минут проводили массаж препуциального мешка, через час массаж повторяли и кольцо снимали. Такую процедуру лечения повторяли два раза с недельным интервалом.

Последующими прижизненными и постмортальными исследованиями и при постановке биопробы ни в одном случае возбудитель болезни от леченных животных не был изолирован, а от всех контрольных его выделили в культуре из половых органов.

Описанный метод лечения при 100-процентной эффективности в восемь раз сокращает труд ветеринарных специалистов и в пять раз - стоимость лечения.

Эффективность лечения быков при любом методе определяют по результатам бактериологического исследования и биопробы на телках, исследования начинают через месяц после лечения. Бактериологическому анализу подвергают сперму и препуциальную слизь три раза с промежутком в 10 дней. Параллельно ставят биопробу. При отрицательных результатах исследований быка признают здоровым и используют как производителя. Если излечение не достигнуто, высокоценных молодых быков подвергают повторному лечению в два курса с проведением исследований после лечения, как указано выше. Малоценных и старых быков повторно не лечат, их выбраковывают. Выбраковывают также животных, не излечившихся при повторном курсе лечения.

Проведение биопробы. Ее ставят на здоровых половозрелых телках. Их отбирают по одной на каждого проверяемого быка в благополучном по кампилобактериозу хозяйстве. Допускается ставить биопробу на выбракованных телках, не имеющих племенной ценности (откормхозяйства). Телок дважды исследуют на вибриоз РА с влагалищной слизью.

Для проведения биопробы берут у исследуемого быка с интервалом 6 - 8 часов две пробы спермы в одну колбу и три смыва из препуция в другую колбу. Для получения смыва и препуциальный мешок через сифон вливают с массажем заднего свода препуция 100 - 150 мл стерильного физиологического раствора.

Смывы из препуция центрифугируют до получения осадка, который добавляют к неразбавленной сперме. Материал для введения быкам хранят при температуре 0 - 4° не более 24-х часов.

Сперму и смывы берут от быков через 30 дней после лечения. В течение месяца до этого не разрешается обрабатывать препуций какими-либо бактерицидными препаратами.

Материал вводят телкам в период охоты или после искусственно вызванной течки подкожной инъекцией СЖК и дозе 1500 - 2000 МЕ или 2 мл 1-процентного синэстрола. Смесь спермы и центрифугата набирают шприцом в количестве 10 - 30 мл, соединяют с полистероловой пипеткой и вводят в канал шейки матки.

Искусственно осемененную телку убивают на 12 - 15-й день для бактериологического исследования на кампилобактериоз. Анализу подвергают шейку, тело, рога матки, яйцеводы, яичники и мочевой пузырь. При получении отрицательного результата бактериологического исследования этих органов быка признают здоровым, а в случае положительного результата - больным.

Племпредприятие считается оздоровленным на основании отрицательных результатов бактериологического исследования и проверки биопробой быков, подвергшихся лечению. Перед снятием ограничений должны быть удалены выбракованные животные и проведен комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий.

На оздоровительных племпредприятиях в течение года исследуют на кампилобактериоз всех быков-производителей один раз в квартал (трехкратное, с интервалом в 10 дней исследование спермы и препуциальной слизи).

Лечение больных кампилобактериозом коров проводят стрептомицином. Его растворяют в 0,5-процентном растворе новокаина и вводят внутримышечно четыре дня подряд по 4 тыс. ЕД/кг массы. В те же дни животным вводят в матку по 1 мл ЕД пенициллина и стрептомицина. Сначала их растворяют в 10 мл дистиллированной воды, а затем взвешивают в 40 - 50 мл стерильного растительного масла.

Положительные результаты дает мазь Конькова, ее вводят в матку по 30 - 50 мл. Для спринцевания влагалища применяют фурациллин 1:5000 или риванол в разведении 1:1000. В период общего лечения эти препараты применяются каждый день.

Нами предложено лечение больных кампилобактериозом коров пенообразующими маточными свечами (ПМС). Они включают: дибиомицин - 2 г, фуразолидон - 1,5 г, карбахолин - 0,008 г и пенообразующий состав до 20 г (Е.Е. Нехаев). Одну-две свечи вводят приборами А.Н. Жабоедова, Г.К. Корчака или рукой, одетой в полиэтиленовую перчатку, один раз в первые 2 - 3 дня после аборта. При взаимодействии с маточным содержимым свечи распадаются с образованием до 1,5 л пены, которая распределяется по всей полости матки и проникает во влагалище. Препараты сохраняются в матке в течение 5 дней и более. Дибиомицин обнаруживают в лечебной концентрации в сыворотке крови, выделяется он с мочой.

Коровам с многократными повторными осеменениями ПМС применяют в период течки, когда открыта шейка матки. Осеменение их в период лечения не проводят.

При применении ПМС общее лечение не рекомендуется.

Из импортных препаратов показано применение септиметрина, экзутера, а из отечественных - трициллина, фуразолидона в палочках.

Коров возвращают в стадо через 10 дней после прекращения выделений из половых органов.

В целях профилактики абортов стельным коровам вводят в течение 4-х дней утром и вечером внутримышечно пенициллин, стрептомицин или окситетрациклин в обычных терапевтических дозах. Можно применять также однократно дибиомицин в дозе 40 тыс. ЕД/кг или бициллин-5 по 20 тыс. ЕД/кг. Для повышения оплодотворяемости коровам и телкам вводят в полость матки по 100000 ЕД стрептомицина и пенициллина через 10 - 12 часов после второго осеменения.

Если в хозяйствах наблюдаются спорадические аборты и из плодов выделяются кампилобактерии интенстинального подвида или непатогенные кампилобактерии, абортировавших коров изолируют, лечат и возвращают в общее стадо. В коровниках и на окружающей территории проводят механическую очистку и дезинфекцию. Ограничений на хозяйство не накладывают.

Неблагополучное по кампилобактериозу хозяйство (ферму, стадо) объявляют оздоровленным, если в течение 12 месяцев после последнего случая заболевания не регистрировались аборты кампилобактериозной этиологии и проведен весь комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий.