Утверждены

Минздравом СССР

12 мая 1983 г. N 2798-83

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БИОПРЕПАРАТА ВИРИН-КШ

НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

 

    Краткая характеристика препарата. Вирин-КШ  - энтомопатогенный

(инсектицидный)  препарат. Предназначается для борьбы с гусеницами

кольчатого   шелкопряда.   Действующее  начало  -  вирус  ядерного

полиэдроза  из семейства бакуловирусов, содержащийся в препарате в

виде  полиэдров.  Полиэдры  -  вирусные  тельца-включения, которые

образуются  в  клетках  тканей  больных  гусениц. Они представляют

собой  многогранники  из  кристаллизованного  белка, содержащие от

десятка до нескольких сотен вирусных частиц. Размеры полиэдров 1 -

3  мк.  Препарат - суспензия полиэдров в 50-процентном глицерине с

                         9

титром  не  менее  1 - 10  пдр/мл.  Применяется путем опрыскивания

плодовых деревьев против гусениц разных возрастов.

Принцип метода. Для выявления микроколичеств препарата вирин-КШ во внешней среде применяется непрямой вариант ИФ-метода (метод Кунса) с использованием кроличьей специфической антиполиэдренной иммунной сыворотки и стандартной меченной флюорохромом ослиной сыворотки против глобулинов кролика.

На объектах и субстратах внешней среды выявляют исключительно полиэдры (тельца-включения), так как свободные вирусные частицы весьма лабильны и легко разрушаются под влиянием различных факторов. Для выявления полиэдров (антигена) готовят специфическую антиполиэдренную иммунную сыворотку. Реакция выявляется под микроскопом в виде ярко-зеленого свечения полиэдров, особенно их ободка.

    Метрологическая  характеристика  метода. Данным методом  можно

                                               2

определить  количество  полиэдров  от  0,5 x 10   и  более  в 1 мл

субстрата.

Избирательность метода. При условии применения качественной гипериммунной антиполиэдренной сыворотки и устранения неспецифического свечения в исследуемых препаратах метод расценивается как специфичный и высокочувствительный, а при наличии специфической антисыворотки так же, как экспресс-метод.

    Реактивы  и  материалы,  приборы  и   посуда.  Люминесцирующая

ослиная   сыворотка   против   глобулинов  кролика,  изготовленная

Институтом эпидемиологии  и   микробиологии   им.   И.Ф.  Гамалеи.

Иммунная специфическая кроличья сыворотка против полиэдров ВЯП КШ.

Нефлюоресцирующее    иммерсионное    масло    или   диметилфталат.

Дистиллированная  вода.  Физиологический  раствор  (0,15 М хлорида

натрия),  pH  7,4  -  7,6.  Ацетон.  Мертиолят  натрия  или борная

кислота.   Синька  Эванса  -  C  H  N Na O   .  Адъювант  Фрейнда.

                               34 24 6  4 144

Антибиотики    (пенициллин,   стрептомицин,   5-нитрооксихинолин).

Люминесцентный микроскоп. Центрифуга ЦЛС-1 или ЦЛН-1 и др. Пипетки

градуированные на 1 и 5 мл. Чашки Петри. Предметные стекла. Пакеты

марлевых салфеток 5 x 5 см.

Отбор проб. Пробы хранят при температуре бытового холодильника 4 °C. Для выявления полиэдров на поверхности объектов проводят смывы с них. Пинцетом берут из заранее приготовленных стерильных пакетов марлевую салфетку (5 x 5 см), смачивают ее в физиологическом растворе (0,15 М NaCl) с pH 7,4 - 7,6, отжимают и тщательно протирают ею исследуемую площадь в 100 кв. см, переносят салфетку в колбу со 100 мл физиологического раствора, энергично встряхивают 5 мин., отжимают салфетку пинцетом и удаляют ее. Смыв фильтруют через 3 слоя марли для удаления грубых частиц, после чего центрифугируют 30 мин. при 5000 об./мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл дистиллированной воды. Если проба состоит из мелких объектов (трава, листья, ягоды и др.), то готовят навеску 200 - 300 г, делают нарезку из мелких листьев, помещают в колбу или широкогорлые банки, добавляют 200 - 300 мл физиологического раствора с pH 7,6, ставят на магнитную мешалку или энергично встряхивают 10 - 15 мин., отстаивают 10 мин., надосадок центрифугируют 30 мин. при 5000 об./мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл дистиллированной воды. Для дальнейших работ пробы хранят при 4 °C до 3 сут.

    Площадь поверхности круглых плодов, например яблок, определяют

                       2

по  формуле  S = пи x r ,  предварительно  измерив  диаметр яблок.

Площадь поверхности листьев определяют следующим образом:  обводят

на бумаге  контур  листка,  по   крайним   точкам  контура  строят

прямоугольник   и   измеряют   его   площадь.   Определяют   массу

прямоугольника   и   массу   вырезанного  контура.  Из  полученной

пропорции вычисляют площадь листка.

    Подготовка к определению. В настоящий  момент антиполиэдренные

сыворотки  централизованно  не  изготавливают. Их можно получить у

авторов  методик,  препарата.  Кроме  того,  их  можно  заказать в

Институте  эпидемиологии  и  микробиологии  им.  Н.Ф. Гамалеи. Для

других  лабораторий,  работающих  с  бакуловирусами, рекомендуется

самостоятельно  изготовить  антисыворотку к полиэдрам, извлеченным

из  препарата  вирин-КШ  или  из  больных гусениц соответствующего

вида.  Очистку  полиэдров ведут путем 3-кратного дифференциального

центрифугирования  при  300  об./мин. 3 мин.; 1000 об./мин. 3 мин.

Супернатант  концентрируют 45 мин. при 5000 об./мин. и температуре

4  °C.  Осадок  суспендируют  в  небольшом объеме дистиллированной

воды.  Дальнейшую  очистку проводят в линейном градиенте плотности

сахарозы.  Наслаивают  60,  50,  40  и  20% концентрации, а сверху

очищаемый материал в соотношении 1:10. Градиенты центрифугируют 30

мин.  при  2000 об./мин. и температуре 4 °C. Образовавшиеся зоны с

очищенными   полиэдрами   отбирают  пипеткой  Пастера  и  3-кратно

отмывают  в дистиллированной воде. Качество очистки контролируют в

люминесцентном  микроскопе. При необходимости очистку в градиентах

плотности   повторяют.   За  сутки  до  введения  животным  взвесь

полиэдров  обрабатывают  антибиотиками  из  расчета 500 - 10000 ЕД

стрептомицина  и пенициллина, 20 мкг/мл 5-нитрооксихинолина. Перед

иммунизацией  взвесь  стерильно отмывают от антибиотиков, полиэдры

ресуспендируют  в  стерильном  растворе. Титр инокулята обычно 1 x

  9

10  пдр/мл.  Приготовленным  антигеном  иммунизируют   беспородных

кроликов  массой  2,5 - 3 кг. Высокотитрованные сыворотки получают

по  следующей  схеме  иммунизации:  3-кратные с интервалом в 3 дня

подкожные  обкалывания с введением соответственно 2,0; 4,0, 6,0 мл

антигена   в   смеси   1:1   адъюванта  Фрейнда.  Через  2  недели

реиммунизация  6,0  мл  смеси  подкожно.  Забор крови через неделю

после реиммунизации.

Сыворотку хранят с консервантом (мертиолят 1:10000) при -20 °C либо лиофилизируют. Высушенная сыворотка сохраняет активность до 5 лет при температуре 4 °C.

Ход анализа. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 кв. см. Затем на стекло микропипеткой наносят 0,02 мл исследуемой суспензии, равномерно распределяют ее по отмеченной площади. Препарат (мазок) подсушивают на воздухе и фиксируют в ацетоне 15 мин. Для гашения неспецифического свечения используют синьку Эванса в разведении 1:10000 дистиллированной водой. Время обработки синькой 10 мин. Препарат промывают проточной водой и подсушивают, после чего он должен иметь слабо-голубую окраску. Затем наносят иммунную сыворотку против полиэдров ВЯП-КШ, предварительно разведенную 1:10 физиологическим раствором, помещают во влажную камеру на 20 мин. при 37 °C, смывают проточной водой, подсушивают на воздухе, после чего наносят меченную ФИТЦ ослиную сыворотку против глобулинов кролика в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают в термостате при 37 °C 20 мин. во влажной камере с последующей промывкой в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентном микроскопе. Препарат просматривают под иммерсией, используя нефлюоресцирующее масло, объектив 90, окуляр 8x. Полиэдры в препарате выявляются по специфическому яркому, желто-зеленому свечению их ободков на общем красноватом фоне препарата.

Контроль: препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической иммунной сыворотки; препараты, обработанные обеими сыворотками, но заведомо не содержащие выявленных полиэдров. В контрольных препаратах свечение полиэдров не выявляется.

Обработка результатов анализа. Кроме визуального (качественный анализ) можно провести количественный анализ, т.е. определить число полиэдров, приходящихся на единицу изучаемой площади. Для этого необходимо предварительно определить площадь поля зрения при данном увеличении или площадь квадрата окулярной сетки (в случае использования окуляра с сеткой). Эти измерения проводят с помощью объект-микрометра.

Количество полиэдров в 1 мл исследуемой суспензии M (концентрат смыва со 100 кв. см поверхности) определяют по формуле:

 

                                 aS

                             M = ---,

                                 VS

                                   1

 

    где:

    a - среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки;

    S - площадь исследуемого мазка, кв. мм;

    S  - площадь квадрата окулярной сетки, кв. мм;

     1

    V - объем нанесенной суспензии, мл.

Количество полиэдров подсчитывают в 100 и более квадратах окулярной сетки.

Пример. Для анализа взяли листья с обработанного препаратом дерева, определили среднюю площадь их поверхности - 100 кв. см. Сделали смыв с листьев и обработали его по способу, описанному выше. Приготовленный препарат покрасили по непрямому методу Кунса.

    При просмотре препарата в люминесцентном микроскопе подсчитали

общее количество полиэдров в 150 квадратах окулярной сетки (SUM

                                                               150

=  320). Отсюда a = 320 / 150 = 2,13. Площадь мазка S = 20 мм x 20

мм  =  400  кв.  мм.  Сторона  квадрата  окулярной сетки 0,0062 мм

(определили   с   помощью   объект-микрометра),  площадь  квадрата

                              2

окулярной сетки  S  = (0,0062)  = 0,00004 кв. мм. Объем нанесенной

                  1

на стекло суспензии V = 0,02 мл.

    Таким образом,

 

        aS      2,13 x 400             9

    M = --- = -------------- = 1,1 x 10 ,

        VS    0,02 x 0,00004

          1

 

                                                                 9

    т.е. на 100 кв. см обследованной площади  приходится 1,1 x 10

                                           7

полиэдров, а на 1 кв. см площади - 1,1 x 10 .

Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы (условно-патогенные).