Утверждены
Минздравом СССР
12 мая 1983 г. N 2799-83
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРЕПАРАТА ВИРИН-ДИПРИОН
НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ
Характеристика препарата.
Вирусный препарат вирин-диприон
предназначен для борьбы
с личинками рыжего соснового пилильщика
(РСП) I
- III возрастов.
Действующее начало препарата - вирус
ядерного полиэдроза (ВЯП)
кишечного типа, содержащийся в
тельцах-включениях (полиэдрах). Препарат жидкой формы
представляет
собой концентрат-суспензию полиэдров
темно-серого цвета с
беловатым осадком
при отстое, состоящим
главным образом из
полиэдров. Размер
полиэдров колеблется от 0,5 до 4 мк, титр 1 x
10
10 пдр/мл. Применяется
путем наземного или
авиационного
опрыскивания
сосновых насаждений, пораженных вредителями.
Принцип метода. ИФ-метод выявления
остаточных количеств вирусного препарата основан на явлении иммунофлюоресценции,
широко используемом в медицинской вирусологии для идентификации
микроорганизмов. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия
антигена (в данном случае полиэдров ВЯП рыжего соснового пилильщика) с
антителами, меченными флюоресцирующим красителем ФИТЦ. Реакция выявляется при
наблюдении в люминесцентном микроскопе в виде специфического свечения комплекса
антиген - антитело (яркое желто-зеленое свечение полиэдров).
Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно
2
определить от 1
x 10 и более полиэдров в 1 мл субстрата.
Избирательность метода. При условии
применения качественных гипериммунных антиполиэдренных
сывороток и устранения неспецифического свечения в исследуемых препаратах метод
расценивается как специфический и высокочувствительный. При
условии централизованного изготовления специфической антисыворотки
ИФ-метод является экспрессным.
Отбор проб. Если проба состоит из мелких
растительных объектов
(хвоя, трава, листья, ягоды), из них готовят навеску
200 - 300 г,
помещают в
широкогорлые банки, доливают
200 -
300 мл
физиологического
раствора с pH 7,4 - 7,6, энергично встряхивают 10
- 15
мин., отстаивают 10
мин., надосадок центрифугируют при
-1
скорости вращения
5 тыс. мин. ,
осадок ресуспендируют в 1 мл
дистиллированной воды.
Для дальнейшей работы
суспензию можно
хранить при
температуре 4 °C до 3 сут.
Реактивы и материалы, приборы и посуда.
Люминесцирующая ослиная сыворотка против глобулинов кролика, изготовленная
Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи.
Иммунная специфическая кроличья сыворотка против полиэдров ВЯП РСП. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат. Дистиллированная вода. Физиологический
раствор (0,15 М NaCl) с pH
7,4 - 7,6. Ацетон. Мертиолат натрия или борная
кислота. Синька Эванса. Антибиотики - пенициллин, стрептомицин,
5-нитрооксихинолин. Люминесцентный микроскоп марки МЛ-2 или МЛ-3. Центрифуга
ПЛС-1 и др. Пипетки градуированные на 1 и 5 мл. Чашки
Петри. Предметные стекла.
Подготовка к определению. Основные
реагенты в данном определении - иммунная сыворотка против ядерного полиэдроза рыжего соснового пилильщика, являющегося
действующим началом препарата вирусного инсектицида вирин-диприон,
а также меченная ФИТЦ сыворотка против глобулинов кролика. Последняя сыворотка
изготовляется в Институте им. Н.Ф. Гамалеи. Что
касается иммунной сыворотки, то для проведения анализа рекомендуется
самостоятельно изготовить антисыворотку к полиэдрам
из препарата вирин-диприон по следующей схеме.
Полиэдры для иммунизации животных
извлекают непосредственно из препарата вирин-диприон,
можно получать их из больных гусениц соответствующего вида. Очистку и
концентрацию полиэдров ведут методами дифференциального центрифугирования и в
градиенте плотности сахарозы.
Взвесь полиэдров за сутки до введения
животным обрабатывают
антибиотиками из
расчета 500 - 1000 ед.
стрептомицина и
пенициллина и
20 мкг/мл 5-нитрооксихинолина.
Перед иммунизацией
взвесь стерильно
отмывают от антибиотиков, полиэдры ресуспендируют
в стерильном
физиологическом растворе. Титр инокулята обычно
9
составлял 1
x 10 пдр/мл.
Приготовленным антигеном иммунизируют
беспородных кроликов
массой по 2,5 -
3 кг по следующей схеме.
Инъекции
проводят внутривенно трижды с недельным интервалом по 1,5
- 2,0 - 2,5 мл, реиммунизацию - через 4 недели внутривенно 2,5 мл.
Кровь берут через 10 дней после реиммунизации.
Сыворотку хранят с
добавлением консерванта
(мертиолат
1:10000) при -20 °C. Лучше
сыворотку лиофилизировать и
хранить при 4 °C. В этих условиях
высушенная
сыворотка сохраняет активность до 5 лет.
Ход анализа. Хорошо обезжиренное
предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен
прямоугольник площадью 4 кв. см. Затем на стекло микропипеткой наносят 0,02 мл
исследуемой суспензии, равномерно распределяя ее по отмеченной площади. Препарат
подсушивают на воздухе, для фиксации опускают в ацетон на 15 мин., после чего
окрашивают синькой Эванса для гашения неспецифического свечения. Используют
синьку Эванса в разведении 1:10000 дистиллированной водой. Время обработки
препарата синькой 10 мин., затем его промывают проточной водой и подсушивают,
после чего он должен иметь слабо-голубую окраску. Затем на препарат наносят антиполиэдренную иммунную сыворотку против ВЯП РСП,
предварительно разведенную 1:10 физиологическим раствором, помещают на 20 мин.
при 37 °C во влажную камеру, затем смывают проточной водой, подсушивают на
воздухе, после чего наносят ослиную меченную ФИТЦ сыворотку против глобулинов
кролика в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают 20 мин. в
термостате при 37 °C во влажной камере с последующим промыванием в проточной
воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентный микроскоп.
Препарат просматривают под иммерсией, используя нефлюоресцирующее
иммерсионное масло, объектив 90, окуляр 8x. Полиэдры в препарате выявляются по
специфическому свечению ярко-желто-зеленого ободка на общем красном фоне.
Контроль: а) препараты, приготовленные по
той же схеме, но без обработки специфической иммунной сывороткой; б) препараты,
обработанные обеими сыворотками, но заведомо не содержащие выявленных
полиэдров. В контрольных препаратах свечения полиэдров не выявляется.
Обработка результатов анализа. Число
полиэдров в 1 мл исследуемой суспензии (концентрат смыва со 100 кв. см
поверхности или 200 - 300 г навески) M вычисляют по формуле:
aS
M = ---,
VS
1
где:
a - среднее число полиэдров в одном
квадрате окулярной сетки;
S - площадь исследуемого мазка, кв. мм;
V - объем нанесенной на стекло суспензии,
мл;
S -
площадь квадрата окулярной сетки, кв. мм.
1
Полиэдры подсчитывают в 100 и более
квадратах окулярной сетки.
Пример. Для анализа взяли навеску хвои
200 г с обработанного препаратом дерева, поместили в колбу. Добавили 200 мл
подщелоченного физиологического раствора. Встряхивали 15 мин. Затем
профильтровали, отцентрифугировали, ресуспендировали осадок в 1 мл дистиллированной воды. Из
суспензии приготовили мазок на предметном стекле, как описано выше. При
просмотре препарата в люминесцентном микроскопе подсчитали общее число
полиэдров в 150 квадратах окулярной сетки:
SUM = 320, отсюда a = 320 :
150 = 2,13.
150
Площадь
мазка известна: S = 20 мм x 20 мм
= 400 кв. мм.
Сторона квадрата
окулярной сетки равна
0,0062 мм (определили с
помощью объект-микрометра), т.е. площадь квадрата окулярной сетки
2
S = (0,0062)
= 0,00004 кв. мм.
1
Объем нанесенной на стекло суспензии V =
0,02 мл.
9
Таким образом, M = (2,13 x 400) / (0,02 x
0,0004) = 1,1 x 10 ,
9
т.е. на 100 кв. см
обследованной площади приходится
1,1 x 10
7
полиэдров, на 1
кв. см площади - 1,1 x 10 .
Требования безопасности. Соблюдаются меры
безопасности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы.