Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

27 апреля 1984 г. N 3024-84

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО УНИФИЦИРОВАННОМУ МЕТОДУ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО

ВЫЯВЛЕНИЯ БАКУЛОВИРУСОВ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

 

1. Краткая характеристика бакуловирусных инсектицидов

 

Известные в настоящее время отечественные вирусные препараты, разрабатываемые, испытываемые или применяемые в качестве инсектицидов против гусениц вредных насекомых, содержат в качестве действующего начала вирусы насекомых семейства бакуловирусов. Вирусы в препаратах представлены в виде телец-включений типа полиэдров или гранул размерами 0,3 - 1,5 мкм (полиэдры) и 0,25 - 0,8 мкл (гранулы), в которых содержатся различные количества вирионов. Бакуловирусы обладают выраженной специфичностью в отношении насекомого-вредителя.

Вирусные тельца - включения получают из тканей больных или погибших от вирусной инфекции гусениц соответствующего вида насекомых.

    Вирусные  препараты  представляют  собой концентрат-суспензию полиэдров

или гранул  в 50% глицерине (жидкие формы) или порошок светло-серого цвета,

состоящий  из соответствующих компонентов действующего начала и наполнителя

(каолин,   силикон,   тальк    и   т.д.).  Препараты  содержат  полиэдры  в

                                  9                        10

концентрации  в  среднем  1  x  10   пдр/мл,  г  или 1 x 10   гранул/мл, г.

Применяются препараты путем опрыскивания  (авиа-,  тракторного,  ранцевого)

при норме расхода  100   -   200  мл   препарата  на  1  га  с  добавлением

поверхностно-активного вещества ОП-7 из расчета 0,6 - 4,0 г на 10 л воды.

По данным КНИИЭИБ, изученные отечественные вирусные энтомопатогенные препараты вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС, вирин-АББ, вирин-КШ, вирин-диприон нетоксичны и непатогенны для человека и теплокровных животных; данные вирусы не репродуцируются в теплокровном организме, не вызывают явной или скрытой инфекции, безопасны в эпидемиологическом отношении. В условиях производства оказывают сенсибилизирующее действие на организм, что может приводить к развитию иммунопатологических состояний у работающих.

 

2. Методика выявления полиэдров

и гранул бакуловирусов в воздухе

 

2.1. Основные положения

 

Методика определения бакуловирусов в воздухе основана на использовании известного явления иммунофлюоресценции, широко применяемого в медицинской вирусологии для индикации различных вирусов (метод Кунса, 1941). Нами используется непрямой вариант метода.

Разработка метода проведена с учетом специфических особенностей энтомопатогенных вирусов, содержащихся в препаратах в виде разнообразных телец-включений (полиэдров или гранул), на фоне сопутствующей микрофлоры и с добавлением наполнителей. Определение проводится только по тельцам-включениям. Для этого разработана методика отбора проб воздуха с помощью электроаспирационного прибора ПАБ-1 на аналитические аэрозольные фильтры и последующей специфической обработки этих фильтров и полученных с них препаратов-отпечатков на предметных стеклах. Можно использовать и другие аспирационные приборы, которые имеются на оснащении санэпидстанций.

При условии приготовления специфической гипериммунной антисыворотки методика пригодна для определения любого бакуловирусного материала.

 

2.2. Принцип метода

 

Метод основан на специфическом взаимодействии антигенов (бакуловирусов) с антителами. На первом этапе препараты с отпечатками антигенов обрабатывают специфической иммунной сывороткой, а затем после промывки на полученный комплекс "антиген - иммунная немеченая сыворотка" наносят люминесцирующую сыворотку против того вида животного, иммунизацией которого была получена иммунная сыворотка.

Микроскопию проводят в падающем свете на люминесцентных микроскопах различных систем. Специфическое взаимодействие выявляется в виде свечения комплекса антиген - антитело (яркое желто-зеленое свечение) телец-включений - полиэдров или гранул.

 

2.3. Метрологическая характеристика метода

 

    Данным методом можно определить концентрацию телец-включений в 1 куб. м

                   2

воздуха от 0,5 x 10  и более.

 

2.4. Избирательность метода

 

При условии использования качественной гипериммунной антисыворотки против полиэдров или гранул определяемого вируса и устранения неспецифического свечения в исследуемых препаратах-отпечатках метод расценивается как высокоспецифический и чувствительный. При этих условиях может рассматриваться как экспресс-метод.

 

3. Реактивы и растворы

 

Ацетон, ГОСТ 2603-71.

Натрий хлористый хч, ГОСТ 4233-77 (0,85% раствор pH 7,4 - 7,6).

Нефлуоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат.

    Синька Эванса - C  H  N Na O   .

                     34 24 6  4 144

Меченая ФИТЦ сыворотка против глобулинов кролика (изготавливается: Москва, Ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи).

Специфическая антибакуловирусная сыворотка против определяемого вируса (изготавливается: Москва, Ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). Можно приготовить в лабораторных условиях по описанию, см. "Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде", часть X, М., 1980, стр. 163 - 164.

 

4. Приборы и посуда

 

Люминесцентный микроскоп МЛ-2 или МЛ-3.

Окуляр с сеткой.

Объект-микрометр.

Электроаспиратор ПАБ-1 или ПОВ-1.

Аналитические аэрозольные фильтры марки АФА-В-10.

Чашки Петри.

Предметные стекла.

Пипетки Пастера.

 

5. Подготовка к определению

 

    До   проведения   исследования  необходимо  подготовить  люминесцентный

микроскоп.  При работе на микроскопах МЛ-2, МЛ-3 используют фильтры ФС-1-2,

                                                          x           x

СС-15-2,  БСК-8-2.  Запирающий  фильтр  Т-2-Н, объектив 90 , окуляры 8  или

  x

10 , сила тока при микроскопии 4 - 4,5 А.

    Для  микроскопии следует применять нефлуоресцирующее иммерсионное масло

или хч диметилфталат.

    Для  проведения подсчета телец-включений в исследуемой пробе необходимо

определить  с помощью объект-микрометра сторону квадрата окулярной сетки, а

затем  ее  площадь.  При  отсутствии  окулярной сетки определяют (с помощью

объект-микрометра)  диаметр  поля  зрения  и  затем  площадь поля зрения по

                       2

формуле  S  =  пи  x  r .  Найденную  величину (площадь окулярной сетки или

площадь  поля  зрения)  подставляют  в  формулу  для определения количества

телец-включений в исследуемой пробе (см. п. 8).

 

6. Отбор проб воздуха

 

Для отбора проб воздуха применяют прибор ПАБ-1 или ПОВ-1, которые имеются на оснащении санитарно-эпидемиологических станций. Производительность приборов до 150 - 250 л/мин. (ПАБ-1) и 20 - 25 л/мин. (ПОВ-1). Этот прибор работает по принципу электростатического или инерционного осаждения частиц аэрозоля из потока исследуемого воздуха на поверхность анализируемых фильтров. Применяют фильтры АФА-ВП-10. Для отсоса воздуха эти фильтры монтируются на фильтровальной воронке или на патроне для отбора проб пыли и подключаются к аспиратору.

Рабочая площадь фильтра АФА-ВП-10 равна 10 кв. см, изготовлены фильтры из перхлорвиниловой ткани ФПП. Обладают малым аэродинамическим сопротивлением, что позволяет протягивать воздух с большой скоростью (до 100 л/мин.).

В исследуемых помещениях пробы отбирают в разных местах (5 точек конвертообразно) на уровне 150 - 200 см от пола в зоне дыхания людей. На каждую пробу пропускают не менее 100 л воздуха (5 мин. при скорости 20 л в мин.).

После пропускания воздуха аналитические фильтры снимают, кладут лицевой стороной (с отпечатком аэрозоля) вверх на предметные стекла, которые помещают в чашки Петри на две стеклянные палочки. На дно чашки наливают ацетон, чашки закрывают. В парах ацетона происходит обесцвечивание фильтров. Когда фильтр станет прозрачным, предметные стекла с зафиксированными на них отпечатками аэрозоля можно хранить при 4 °C до проведения исследования (не более 30 суток).

 

7. Проведение определения

 

Исследованию подвергаются зафиксированные на предметных стеклах отпечатки аэрозоля, полученные на обесцвеченных аналитических фильтрах.

На стекла с отпечатками наносится водный раствор (1:10000) синьки Эванса на 15 мин., затем стекла промывают в проточной воде и подсушивают на воздухе (для ускорения подсушивания можно применять комнатный вентилятор). На высушенный препарат наносится специфическая антиполиэдренная иммунная сыворотка в рабочем разведении, выдерживается 20 мин. во влажной камере при 37 °C. Сыворотка смывается в проточной воде, препарат подсушивают и наносят антивидовую меченую ФИТЦ сыворотку на 20 мин. при 37 °C, затем промывают в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентном микроскопе.

При наличии в отпечатках телец-включений бакуловирусов они будут выявляться в микроскопе по яркому специфическому желто-зеленому свечению. Более интенсивно светятся тельца-включения по их периферии в виде яркого ободка полиэдров или гранул на общем красноватом фоне препарата.

В случае получения отпечатков на нескольких фильтрах можно проводить окраску каждого или группы отпечатков разными специфическими иммунными сыворотками и таким образом осуществлять экспресс-идентификацию выявляемого бакуловируса. Этим способом также выявляется степень серологического родства разных видов бакуловирусов.

 

8. Обработка результатов анализа

 

Кроме визуального определения наличия телец-включений бакуловирусов (качественный анализ) можно произвести количественный анализ на единицу объема.

Подсчитывают число телец-включений в 100 - 500 полях зрения, при этом общее количество подсчитанных частиц должно быть не менее 400. Затем определяют среднее количество включений в одном поле зрения или в одном квадрате окулярной сетки.

Расчет ведут по формуле:

 

                                  a x S x n

                              M = ---------,

                                    V x S

                                         1

 

    где:

    M - число включений в одном куб. м воздуха;

    a - среднее число включений в квадрате окулярной сетки (поле зрения);

    S - площадь мембранного фильтра в кв. мм;

    V - объем пропущенного воздуха в литрах;

    S  - площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения);

     1

    n - переводной коэффициент на 1 куб. м.

    Пример  расчета:  для  анализа получены предметные стекла с отпечатками

аэрозоля на них. Препараты покрасили по непрямому методу Кунса, как описано

в п. 7.

    При  осмотре препаратов под люминесцентным микроскопом установлено, что

в  одном квадрате окулярной сетки обнаруживается в среднем 0,5 включения со

специфическим  свечением  (полиэдров),  a = 0,5. Сторона квадрата окулярной

сетки  при  объективе  90,  окуляре  8  равна 0,12 мм (определили с помощью

объект-микрометра). Площадь  квадрата окулярной сетки равна S  = 0,0144 кв.

                                                             1

мм.

                                                      4

    Площадь мембранного фильтра S = 10 кв. см, т.е. 10  кв. мм.

    Объем пропущенного воздуха V = 100 л, n = 10.

    Подставляем показатели в формулу:

 

                                         4

                     a x S x n   0,5 x 10  x 10

                 M = --------- = -------------- = 34722,2.

                       V x S      100 x 0,0144

                            1

 

    Таким  образом, в 1 куб. м воздуха рабочей зоны содержится около  3,5 x

  4

10  определяемых полиэдров.

 

9. Требования безопасности

 

Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые при работе с микроорганизмами IV группы (условно патогенные).