Утверждены
Минздравом СССР
27 ноября 1984 г. N 3158-84
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОКОЯЩИХСЯ СПОР
ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ (МИКОАФИДИНА, ЭНТОМОФТОРИНА)
МЕТОДОМ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
Энтомофторовые
грибы, в частности Entomophthora thaxteriana,
используются для
производства средств защиты
растений
(микоафидина, энтомофторина и др.). В состав микоафидина
входят
7
покоящиеся споры
указанного вида гриба (не менее 4 x 10
в 1 г),
фрагменты мицелия
и остатки питательной
среды. Препарат -
мелкодисперсный аморфный
порошок желтого или
бежевого цвета,
имеющий слабый
специфический (грибной) запах. Гигроскопичен. В
воде образует
нестойкую суспензию. У энтомофторина
состав и
свойства подобны
описанным.
Токсичность микоафидина и
энтомофторина
низкая. ЛД для белых мышей и крыс при введении в
50
желудок превышает
10 г/кг. ПДК (ориентировочная) в воздухе рабочей
3
зоны 5 x 10 спор/куб. м.
Микоафидин и энтомофторин используются в качестве
контактных инсектицидов против тлей. Препараты применяют с помощью опрыскивания
вегетирующих растений.
Краткая характеристика препарата. Энтомофторовые грибы - эффективное средство борьбы с тлями.
Грибы этого рода образуют два вида спор: конидии (инфекционные частицы) и
покоящиеся споры, позволяющие сохраняться и выживать в неблагоприятных
условиях. Эта стадия гриба используется для получения биопрепарата. Покоящиеся
споры получают в массовом количестве в биолабораториях.
Принцип метода. Метод основан на
осаждении на аналитические фильтры типа АФА из перхлорвинила, просветлении
фильтра в парах ацетона, подсчете покоящихся спор энтомофторовых
грибов на фильтрах методом микроскопии в проходящем свете, расчете содержания
спор в воздухе.
Метрологическая характеристика метода.
Диапазон определения
2 5
количества спор на фильтре 12 x 10 - 6 x 10 . Предел обнаружения
2
5 x 10
спор на фильтре. Среднее значение определения стандартных
количеств спор 82%.
Стандартное отклонение отдельного определения
26,1%. Относительное
стандартное отклонение 0,2. Доверительный
интервал
среднего при p = 0,05 +/- 29,4%.
Избирательность метода. Метод избирателен
в присутствии посторонней микрофлоры, минеральных и органических частиц.
Определению мешает избыток пыли на фильтре, если ее количество превышает 3 - 5
мг.
Реактивы и материалы. Ацетон х.ч. Этанол 96-процентный. Диэтиловый
эфир (для наркоза). Вода дистиллированная. Мешки полиэтиленовые хозяйственные.
Формалин. Фильтры АФА-ВП-20 или АФА-ХП-20. Вата обезжиренная медицинская.
Приборы и аппаратура. Аспирационное
устройство. Аллонжи ИРА-2000. Трубки соединительные резиновые. Микроскоп МБИ-3
или аналогичный. Стекла предметные и покровные 24 x 24 мм. Микрометр окулярный
винтовой МОВ-1-15. Объект-микрометр ОМП. Кювета металлическая (150 x 100 x 30
мм) со стеклянной крышкой. Баня водяная. Колбы конические на 100 мл.
Подготовка к определению. Отбор,
транспортировку, хранение и анализ проб проводят при соблюдении правил
асептики. Аналитические аэрозольные фильтры и аллонжи стерилизуют в парах
формалина (в полиэтиленовых мешках, завернутыми в бумагу) в течение 24 ч при
комнатной температуре. Площадь поля зрения микроскопа определяют при помощи
микрометра окулярного и объект-микрометра. Предметные
и покровные стекла обрабатывают смесью этанола с эфиром (1:1).
Отбор проб. Споры энтомофторовых
грибов улавливают на аналитические аэрозольные фильтры из перхлорвинила путем
фильтрации через них исследуемого воздуха. Через фильтр пропускают 500 - 600 л
воздуха со скоростью 5 - 20 л/мин. Пробы можно хранить продолжительное время
при температуре 2 - 5 °C.
Ход анализа. Фильтр с пробой наносят на
предметное стекло (аэрозольными частицами вверх), свисающие части фильтра
срезают ножницами. Предметное стекло помещают в металлическую кювету над слоем
кипящего ацетона (подогревают на водяной бане, работу проводят в вытяжном
шкафу) и накрывают крышкой. Под воздействием паров ацетона фильтр осветляется в
течение 5 - 10 с. Предметное стекло извлекают из кюветы, ацетон в течение 10 -
20 с испаряется. Споры на фильтре подсчитывают путем
микроскопии в проходящем свете при увеличении 20 x 7 или 20 x 10 в препарате
"раздавленная капля". Для этого на просветленный фильтр наносят на 2
участка на расстоянии 30 - 35 мм по одной капле дистиллированной воды и
накрывают покровным стеклом. Количество покоящихся спор подсчитывают в 50 полях
зрения микроскопа (по 5 x 5 на обоих участках фильтра). Для равномерного обзора
всего участка фильтра споры подсчитывают в полях зрения, расположенных не
подряд, а с интервалом в 2 - 3 поля. Покоящиеся споры энтомофторовых
грибов имеют округлую форму и четко различимую двойную оболочку. В центре споры
располагается крупная "жировая капля". Споры имеют размеры от 27 до
50 мкм, а "жировая капля" - 12 - 20 мкм.
Обработка результатов анализа.
Концентрацию покоящихся спор энтомофторовых грибов в
воздухе (X, спор/куб. м) вычисляют по формуле:
1000Sn
X = -------,
S n V
1 1 20
где:
S -
площадь аналитического
аэрозольного фильтра (той части,
через которую проходит
воздух при закреплении фильтра в аллонже),
кв. мм;
S -
площадь поля зрения микроскопа, кв. мм;
1
n - число подсчитанных спор энтомофторовых грибов;
n -
число просмотренных полей зрения микроскопа;
1
V -
объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к
20
стандартным
условиям, л;
1000 - коэффициент пересчета литров в метры
кубические.
Требования безопасности. Соблюдаются общие
правила по технике безопасности при работе с легковоспламеняющимися жидкостями
и электроприборами. Выполняются меры предосторожности, рекомендуемые для работы
с условно-патогенными микроорганизмами, сущность которых сводится к
предупреждению загрязнения проб и соблюдению правил личной гигиены.