Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
27 ноября 1984 г. N 3158-84
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПОКОЯЩИХСЯ СПОР
ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ (МИКОАФИДИНА, ЭНТОМОФТОРИНА)
МЕТОДОМ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
Энтомофторовые грибы,
в частности Entomophthora thaxteriana,
используются для производства
средств защиты растений
(микоафидина,
энтомофторина и
др.). В состав
микоафидина
входят покоящиеся споры
7
указанного вида
гриба (не менее 4 x 10 в 1 г), фрагменты
мицелия и остатки
питательной среды.
Препарат представляет собой мелкодисперсный аморфный
порошок желтого или бежевого цвета, имеющий слабый
специфический (грибной)
запах. Гигроскопичен. В воде образует нестойкую
суспензию. У энтомофторина
состав и
свойства подобны описанным.
Токсичность
микоафидина и энтомофторина
низкая: ЛД для белых мышей и
50
крыс при
введении в желудок
превышает 10 г/кг. ПДК (ориентировочная) в
3
воздухе рабочей зоны - 5 x 10 спор/куб. м.
Микоафидин и энтомофторин используются в качестве
конкретных инсектицидов против тлей. Препараты применяются методом опрыскивания
вегетирующих растений.
1. Методика
определения покоящихся спор
энтомофторовых грибов в воздухе методом световой
микроскопии
1.1. Основные
положения
1. Метод основан на осаждении аэрозоля на аналитические фильтры типа АФА из
перхлорвинила, просветлении фильтров в парах ацетона, подсчете покоящихся спор энтомофторовых грибов на фильтрах методом микроскопии в
проходящем свете, расчете содержания спор в воздухе.
2
2.
Диапазон определяемых количеств спор на фильтре - 12 x 10 - 6 x
5
10 .
2
3. Предел обнаружения спор на фильтре - 5 x
10 .
4. Среднее значение определения
стандартных количеств спор - 82%.
5. Стандартное отклонение отдельного
определения - 26,1%.
6. Относительное стандартное отклонение -
0,2.
7. Доверительный интервал среднего при P
= 0,05 и n = 5 - +/- 29,4%.
8. Метод избирателен в присутствии
посторонней микрофлоры, минеральных и органических частиц. Мешает определению
избыток пыли на фильтре - если ее количество превышает 3 - 5 мг.
1.2. Реактивы и
материалы
Ацетон хч, ГОСТ
2603-79.
Этанол 96-процентный, ТУ 6-09-1710-77.
Эфир диэтиловый
(для наркоза), Фармакопея СССР.
Вода дистиллированная, ГОСТ 6702-72.
Мешки полиэтиленовые хозяйственные, ОСТ
6-19-37-033-82.
Формалин, Фармакопея СССР.
Фильтры АФА-ВП-20 или АФА-ХП-20.
Вата обезжиренная медицинская, ГОСТ 5566-75.
1.3. Приборы,
аппаратура и посуда
Аспирационное устройство, ТУ 64-1-862-77.
Аллонжи ИРА-2000, ТУ 690-00-00.
Трубки соединительные резиновые.
Микроскоп МБИ-3 и т.п.
Стекла предметные.
Стекла покровные, 24 x 24 мм, ГОСТ
6672-75.
x
Микрометр окулярный винтовой МОВ-1-15 ,
ГОСТ 7865-56.
Объект-микрометр ОМП, ГОСТ 7513-75.
Кювета металлическая (150 x 100 x 30 мм)
со стеклянной крышкой.
Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76.
Колбы конические на 100 мл, ГОСТ
10394-72.
1.4. Подготовка к
определению
Отбор, транспортировку, хранение и анализ
проб проводят при соблюдении правил асептики. Аналитические аэрозольные фильтры
и аллонжи стерилизуют в парах формальдегида (в полиэтиленовых мешках, завернутыми в бумагу) в течение 24 часов при комнатной
температуре. Площадь поля зрения микроскопа определяют при помощи микрометра
окулярного и объект-микрометра. Предметные и покровные
стекла обрабатывают смесью этанола с эфиром (1:1).
1.5. Отбор проб
Улавливание спор энтомофторовых
грибов осуществляют на аналитические аэрозольные фильтры из перхлорвинила путем
фильтрации через них исследуемого воздуха. Через фильтр пропускают 50 - 600 л
воздуха со скоростью 5 - 20 л/мин. Пробы можно хранить продолжительное время
при температуре 2 - 5 °C.
1.6. Проведение
определения
Фильтр с пробой помещают на предметное
стекло (аэрозольными частицами вверх), свисающие части фильтра отрезают
ножницами. Предметное стекло с фильтром помещают в металлическую кювету над
слоем кипящего ацетона (подогревают на водяной бане, работу проводят в вытяжном
шкафу) и накрывают стеклянной крышкой. Под воздействием паров ацетона
происходит просветление фильтра в течение 5 - 15 с. Предметное стекло извлекают
из кюветы, ацетон в течение 10 - 20 с испаряется.
Подсчет спор на фильтре проводят путем
микроскопии в проходящем свете при увеличении 20 x 7 или 20 x 10 в препарате
"раздавленная капля". Для этого на просветленный фильтр наносят на
два участка на расстоянии 30 - 35 мм по одной капле дистиллированной воды и
накрывают покровными стеклами. Подсчитывают количество покоящихся спор в 50
полях зрения микроскопа (по 5 x 5 на обоих участках фильтра). Для равномерного
обзора всего участка фильтра споры подсчитывают в полях зрения, расположенных
не подряд, а с интервалами в 2 - 3 поля. Покоящиеся споры энтомофторовых
грибов имеют округлую форму и четко различимую двойную оболочку. В центре споры
располагается крупная "жировая капля". Спора имеет размеры от 27 до
50 мкм (в среднем 33 мкм), а "жировая капля" - 12 - 20 мкм.
1.7. Обработка
результатов
Концентрацию покоящихся спор энтомофторовых грибов в воздухе (X, спор/куб. м) вычисляют
по формуле:
S x N x 1000
X = -------------,
S x N x V
1 1
20
где:
S -
площадь аналитического аэрозольного
фильтра (той части, через
которую проходит воздух при закреплении фильтра в аллонже),
кв. мм;
S -
площадь поля зрения микроскопа, кв. мм;
1
N - количество подсчитанных спор энтомофторовых грибов, ед.;
N -
количество просмотренных полей зрения микроскопа, ед.;
1
V -
объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным
20
условиям, л;
1000 - коэффициент пересчета литров в метры
кубические.
2. Требования
безопасности
Соблюдаются общие правила по технике
безопасности при работе с легковоспламеняющимися жидкостями и электроприборами.
Выполняются меры предосторожности, обычно рекомендуемые для работы с
микроорганизмами IV группы (условно патогенные), сущность которых сводится к
предупреждению загрязнения проб и соблюдению правил личной гигиены.