Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
27 ноября 1984 г. N 3162-84
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ПРЕПАРАТА ГИББЕРСИБ
В ВОДЕ И ПОЧВЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
1. Краткая
характеристика препарата
Основное
действующее начало препарата
гибберсиб
- натриевая соль
гиббереловой кислоты (или гибберелин
А ).
3
O
//\/│
// /\│───┐ C H O Na.
│ CO │ │/ \ 19 21 6
│ │ │
│ │
/ \
/ \ /│\ /│...OH М.м. 368.
HO │ │ └───┘=CH
CH
COONa
2
3
Гибберсиб представляет собой мелкий однородный гигроскопичный порошок,
получаемый высушиванием на распылительной сушилке продуктов метаболизма грибка Fusarium moniliforme Sheld. Гибберсиб является смесью
натриевых солей гиббереловой, карбоновых кислот и
карбоната натрия.
Растворимость гибберсиба
в воде при 20 °C - 2 г/л. Растворим в этиловом и метиловом спиртах,
этилацетате, ацетоне. Нерастворим в бензоле, гексане.
Применяется в качестве регулятора роста
растений (томаты, виноград) в период цветения.
2. Методика
определения действующего препарата гибберсиб
2.1. Основные
положения
2.1.1. Принцип метода
Определение
основано на экстракции
гибберелинов
из воды и
почвы
этилацетатом с
последующей тонкослойной хроматографией экстракта
на
пластинках "Силуфол".
Обнаружение гибберелина А проводят
обработкой
3
пластинок
70-процентной серной кислотой и проявлением в УФ-свете.
2.1.2. Метрологическая характеристика
метода
Диапазон
определяемых концентраций - 0,05
- 0,5 мг/л в воде и 0,4 - 5
мг/кг в
почве. Предел обнаружения препарата на пластинках - 3 мкг. Предел
обнаружения в
воде - 0,05
мг/л, в почве - 0,4 мг/кг.
Среднее значение
определения
стандартных количеств гибберелина А
: 74% - вода, 66% - почва.
3
Стандартное отклонение:
вода - 12, почва - 9. Относительное стандартное
отклонение: вода - 16%, почва - 14%. Доверительный
интервал среднего при p
= 0,95 и n = 5
для воды +/- 15 и для почвы +/- 14%.
2.1.3. Избирательность метода
Определению
не мешают соли
других гибберелинов А , А , А
, А ,
4 7 9
14
неорганические
компоненты и экстрактивные вещества из почвы.
2.2. Реактивы и
материалы
Этиловый эфир уксусной кислоты
(этилацетат) ч, ГОСТ 8981-78.
Хлороформ медицинский, фармакопея СССР.
Метанол чда,
ГОСТ 6995-77.
Кислота серная хч,
ГОСТ 4204-77, 70-процентный раствор.
Аммиак водный технический, ГОСТ 9-77.
Гибберелин кристаллический (А ~
80%), ТУ 64-3-103-75.
3
Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77.
Уксусная кислота ледяная, ГОСТ 61-75.
Хроматографические
пластинки "Силуфол" (ЧССР).
Стандартный раствор
гибберелина А
с содержанием 1000
мкг/мл
3
этилацетата.
2.3. Приборы,
аппаратура и посуда
Ультрахемископ типа "Хроматоскоп".
Центрифуга типа ЦЛС-31М.
Ротационный испаритель ИР-1М или любой
другой.
Весы аналитические типа ВЛР-200 (отсчет
до 0,0001 г).
Весы технические типа ВЛТК-500.
Универсальная встряхивающая машина типа
К-203 лабор. 2162.
Камера для хроматографии из комплекта
КТХ-01 или сосуды цилиндрические типа СЦ.
Пульверизатор стеклянный.
pH-метр типа pH-262.
Воронка делительная типа ВД-1-250, ГОСТ
25336-82.
Колбы типа КнКШ-100, 250-29/32,
ГрКШ-10-14/23, ГОСТ 25336-82.
Пипетка 1-1-1, ГОСТ 20292-74.
Линейка измерительная металлическая, ГОСТ
427-75.
Микрошприц 100 мкл.
Капилляры стеклянные.
Сито с отверстиями 1 мм.
2.4. Подготовка к
определению
2.4.1. Приготовление системы
растворителей
Смешивают хлороформ с метанолом в соотношении
10:1 (система I) и хлороформ, метанол с уксусной кислотой в соотношении
10:1:0,1 по объему (система II).
2.4.2. Отбор проб
Отбор пробы производится в соответствии с
Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции,
продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (МЗ СССР, ГСЭУ, Москва, 1980 г.,
N 2051-75 от 21.02.79).
Анализы производят в день отбора проб или
на следующий день.
2.5. Проведение
определения
2.5.1. Экстракция гибберелина
Вода. К 200 мл воды приливают 80 мл 0,5%
раствора аммиака, смешивают на встряхивающей машине в течение 15 мин. и доводят
pH раствора до 2,2 +/- 0,2. Затем приливают 25 мл
насыщенного раствора хлористого натрия и экстрагируют в делительной воронке
этилацетатом порциями по 50, 40, 40 мл. Этилацетатный
экстракт освобождают от воды на центрифуге (10 мин. при 5000 об./мин.) и упаривают до объема ~ 0,1
- 0,2 мл.
Почва. Почву просеивают через сито с
отверстиями 1 мм. К 100 г почвы приливают 80 мл 0,5-процентного раствора
аммиака, гомогенизируют в течение 15 мин. на встряхивающей машине и осаждают на
центрифуге в течение 10 мин. при 5000 об./мин. Надосадочную жидкость
сливают, осадок промывают 30 мл 0,5-процентного раствора аммиака, еще раз
центрифугируют. Объединяют обе порции и доводят pH до
2,2 +/- 0,2. Приливают 25 мл насыщенного раствора хлористого натрия и
экстрагируют в делительной воронке этилацетатом порциями по 50, 40, 40 мл. Этилацетатный экстракт освобождают от хлопьев и воды на
центрифуге (при 5000 об./мин.,
10 мин.). Экстракт сливают, отделяя воду на делительной воронке, а осадок
промывают 10 мл этилацетата, еще раз центрифугируют, объединяют с экстрактом и
упаривают до объема ~ 0,1 - 0,2 мл.
2.5.2. Хроматографирование
и проявление
Экстракт
из воды. Упаренный
экстракт количественно наносят
на
хроматографическую
пластинку (диаметр пятна 10 - 12 мм) при помощи пипетки
с оттянутым
концом, капилляром или микрошприцем и
параллельно наносят
стандартный
раствор (3 - 20 мкг), подсушивают на воздухе и хроматографируют
в системе
растворителей I (хлороформ
- метанол 10:1 по объему). После
окончания хроматографирования пластинки подсушивают под тягой и
опрыскивают
из пульверизатора 70-процентной серной
кислотой. Хроматограммы
рассматривают в УФ-свете.
Обводят контуры пятен,
соответствующих
гибберелину А в пробе и стандарте.
3
Экстракт из почвы. На хроматографическую
пластинку в левый угол на расстоянии 15 - 20 мм от края пластинки наносят
упаренный экстракт из почвы (диаметр пятна 10 - 12 мм) и хроматографируют
в системе II (хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота 10:1:0,1). После
того как фронт растворителя дойдет до края пластинки, ее извлекают из хроматографической камеры, поворачивают на 90° и помещают в
ту же систему для хроматографирования. Так же
поступают со стандартным раствором, нанесенным на другую пластинку. После хроматографирования пластинки обрабатывают серной кислотой,
как указано для воды.
2.6. Обработка
результатов анализа
С помощью линейки или миллиметровой
бумаги измеряют размеры пятен на хроматограммах проб
и стандартных растворов, вычисляют их площади.
Содержание гибберелина А в мг/л или мг/кг
вычисляют по формуле:
3
A x S
2
C = ------,
S x P
1
где:
A - количество стандартного раствора, мкг;
S -
площадь пятна на хроматограмме пробы, кв. мм;
2
S -
площадь пятна на хроматограмме стандарта, кв. мм;
1
P - масса или объем пробы, взятые для
анализа, г или мл.
3. Требования
безопасности
Выполняются требования по технике
безопасности, необходимые при работе в химических лабораториях.