Утверждены
Минздравом СССР
29 декабря 1984 г. N 3184-84
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ
Т-2 ТОКСИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ
МЕТОДИКА
ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т-2 ТОКСИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ
Оборудование и
материалы
1. Аппарат для встряхивания проб типа
АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.
2. Ротационный испаритель с ловушкой по
ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлабприбор").
3. Кофемолка ЭКМ-ЗУ.
4. Хроматограф газовый
серии "Цвет-100" с детектором постоянной скорости рекомбинации (ДЭЗ);
колонка стеклянная 1 м x 0,4 см с жидкой фазой OV-1 или OV-101 на Хроматоне N-супер ("Лахема",
ЧССР); в качестве самописца - регистрирующий потенциометр КСП-4 модификации
41.130.90.909 или 41.140.90.910 с диапазоном измерений 1 мВ; газ - носитель и
продувочный газ - азот особой чистоты.
5. Прибор для флуоресцентного анализа
витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа
ОЛД-41.
6. Магнитная мешалка любого типа.
7. Микрошприц
МШ-10 на 10 мкл, микрошприц
МШ-1 или "Газохром-101" на 1 мкл.
8. Камеры для ТСХ с притертыми крышками
(например, стеклянные четырехугольные сосуды 195 x 195 x 200 завода
"Дружная горка").
9. Пластины для ТСХ "Силуфол" размером 20 x 20 см (ЧССР).
10. Воронки делительные ВД-2-250 по ГОСТ
8613-75.
11. Колбы плоскодонные конические на 250
мл с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-72.
12. Колбы круглодонные на 250 мл с НШ 29,
тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10394-72.
13. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5,
тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-72.
14. Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2
по ГОСТ 1770-74.
15. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой
пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.
16. Распылитель стеклянный с грушей.
17. Т-2 токсин кристаллический, номер по
каталогу Т 4887, фирма "Сигма", США (по
поводу получения стандарта Т-2 токсина обращаться в Институт питания АМН СССР).
18. Ацетонитрил
ч. по ТУ 6-09-3534-74.
19. Ацетон ч.д.а.
по ГОСТ 2603-79.
20. Бензол ч.д.а.
по ГОСТ 5955-75.
21. Гексан ч.
по ТУ 6-09-3375-78.
22. Метанол ч.д.а.
по ГОСТ 6995-77.
23. Изопропиловый спирт (пропанол-2) х.ч. по ТУ 6-09-402-75.
24. Кислота серная ч.д.а.
по ГОСТ 4204-77.
25. Калий хлористый ч.д.а.
по ГОСТ 4234-77.
26. Натрий сернокислый безводный ч.д.а. по ГОСТ 4166-76.
27. Натрий углекислый ч.д.а.
по ГОСТ 83-79, свежепрокаленный.
28. Трифторуксусный ангидрид ч. по ТУ
6-09-4135-75.
1. Экстракция
При отборе пробы для анализа следует
руководствоваться требованиями ГОСТ 12430-66 "Сельскохозяйственная
продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе".
Отобранную пробу измельчают в течение 1 - 2 минут в кофемолке или лабораторной
мельнице. Навеску 20 г измельченного продукта помещают в плоскодонную
коническую колбу на 250 мл, добавляют 10 мл 4% раствора хлористого калия и 90
мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для
встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный
складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 70 мл фильтрата (аликвота соответствует 14 г исходного образца).
2. Очистка
экстракта
2.1. Жидкость -
жидкостная экстракция
В делительную воронку на 250 или 500 мл
переносят 70 мл фильтрата, добавляют 50 мл гексана
(или гептана). После встряхивания и разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой
еще дважды встряхивают с 40 мл гексана, каждый раз
отбирая верхний гексановый слой. Ацетонитрильный слой
разбавляют 17 мл дистиллированной воды и экстрагируют 50 и 25 мл бензола.
Верхние бензольные слои отделяют и сушат безводным
сернокислым натрием (10 - 15 г) в течение 0,5 часа. Раствор фильтруют через
химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 250 мл в НШ 29.
Сернокислый натрий промывают 10 мл бензола и отфильтровывают бензол в ту же
круглодонную колбу. Упаривают бензольный раствор на
ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45 - 50 °C досуха.
Остаток растворяют в 200 - 300 мкл бензола и очищают
с помощью препаративной ТСХ (раствор A).
2.2. Очистка с
помощью препаративной ТСХ
Пластинку "Силуфол"
(20 x 20 см) размечают. В правом и левом нижних углах пластинки на расстоянии
1,5 см от краев наносят по 5 мкл стандартного
раствора Т-2 токсина в бензоле (по 500 нг Т-2
токсина). Параллельно нижнему краю пластинки на расстоянии 1,5 см от нижнего
края равномерно наносят с помощью шприца на 10 мкл
раствор A в виде прямой линии шириной не более 3 мм. После нанесения всего
раствора A в круглодонную колбу добавляют еще 100 - 150 мкл
бензола и наносят бензольную промывку на ту же прямую
линию. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан
- изопропиловый спирт (7:2). Развивают пластинку до достижения фронтом
растворителя карандашной линии, проведенной в 1,5 см от верхнего края
пластинки. Пластинку извлекают из камеры и высушивают. Разрезают пластинку по
линиям А и Б. Узкие полоски пластинки с нанесенным
раствором Т-2 токсина опрыскивают 20% раствором серной кислоты в метаноле.
Пластинки выдерживают в сушильном шкафу при 105 °C в течение 1 - 3 минут и
рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Пятна Т-2
токсина (бело-голубая флуоресценция, Rf 0,6 - 0,7)
обводят тонкой карандашной линией. Затем узкие полоски прикладывают к пластинке
с нанесенным экстрактом и отмечают на этой пластинке зону, соответствующую хроматографической подвижности стандарта Т-2 токсина.
Ширина зоны должна быть примерно на 7 мм (с каждой стороны) больше протяженности
пятна стандарта Т-2 токсина в направлении развития хроматограммы;
зону отмечают в виде 2 карандашных линий, параллельных нижнему краю пластинки.
Силикагель из отмеченной зоны соскабливают с помощью скальпеля или шпателя в
пробирку на 5 мл, приливают 4 мл смеси бензол - ацетон (1:1) и встряхивают.
Суспензию силикагеля фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в
грушевидную колбу на 50 мл с НШ 14,5. Силикагель повторно (2 x 4 мл) промывают
смесью бензол - ацетон (1:1). Объединенные бензол - ацетоновые экстракты
упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток переносят 200 мкл бензола в пробирку на 5 мл с НШ 14,5 (раствор B).
3. Обнаружение,
идентификация и определение
содержания Т-2 токсина
3.1. Приготовление
стандартного раствора Т-2 токсина
Навеску 10 мг кристаллического Т-2
токсина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки бензолом.
Концентрация Т-2 токсина в стандартном растворе составляет 100 нг/мкл или 100 мкг/мл. Раствор
хранят в холодильнике при температуре не выше +5 °C. Срок годности стандартного
раствора - до 2 лет.
3.2. Получение ТФА
производных
а) Получение ТФА производного стандарта
Т-2 токсина
В мерную пробирку на 5 мл в НШ 14,5
добавляют 50 мкл стандартного раствора Т-2 токсина в
бензоле, добавляют 250 мкл бензола, 30 - 50 мг
свежепрокаленного углекислого натрия и 50 мкл
трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой
пробкой и перемешивают при 20 - 25 °C в течение 0,5 часа на магнитной мешалке
(в пробирку предварительно помещают "гвоздик" для перемешивания -
кусочек металлической канцелярской скрепки длиной 3 - 4 мм, запаянный в
стеклянный капилляр). Содержимое пробирки разбавляют бензолом до 1 мл и
фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в другую пробирку на 5 мл с
НШ 14,5, углекислый натрий на фильтре промывают 0,5 мл бензола. Объединенные бензольные фильтраты упаривают досуха в слабой струе азота
(при отсутствии баллона с азотом можно упарить досуха на ротационном
испарителе). Остаток растворяют в 200 мкл бензола и
анализируют с помощью ГЖХ.
б) Получение ТФА производных экстракта
К 300 мкл бензольного раствора очищенного экстракта (раствор B)
добавляют углекислый натрий и трифторуксусный ангидрид и проводят получение ТФА
производных аналогично п. 3.2.а.
3.3. ГЖХ анализ ТФА
производных
Условия ГЖХ анализа: температура колонки -
200°, температура испарителя
- 235°,
температура термостата детектора - 270°, скорость газа-носителя -
90 -
100 мл/мин., скорость продувочного газа - 190 - 200 мл/мин., шкала
-12
чувствительности
- 2 x 10 А
(на блок ИМТ).
В
газовый хроматограф с помощью микрошприца
на 1 мкл последовательно
вносят 0,2
и 0,5 мкл (соответствуют 5 и 12,5 нг Т-2
токсина) раствора
ТФА -
производного стандарта Т-2 токсина в 200 мкл бензола (п. 3.2.а). В
каждом случае регистрируют время удерживания (в данных условиях
порядка 5 -
6 минут)
и определяют площадь пика ТФА производного Т-2
токсина (S ).
ст
Площадь пика
определяют умножением высоты пика на ширину пика на половине
его высоты.
Затем в газовый хроматограф вносят 0,5 - 1,0 мкл
раствора ТФА
производного экстракта
(п. 3.2.б). При наличии пика,
соответствующего по
времени удерживания
ТФА производному Т-2
токсина, определяют площадь
(S ).
обр
Содержание Т-2 токсина в исходном образце
определяют по формуле:
V
x V x S
x m
1 3 обр ст
C = --------------------, (мкг/кг),
V x V
x S x M
2 4 ст
где:
S
- площадь пика ТФА производного Т-2 токсина в экстракте, в кв. мм;
обр
S -
площадь пика ТФА производного стандарта Т-2 токсина, в кв. мм;
ст
m
- масса стандарта Т-2 токсина, внесенная
в хроматограф, в нг
ст
(5 или 12,5 нг);
M - масса исходного образца, в г (20 г);
V -
объем экстрагирующего растворителя, в мл (100 мл);
1
V -
объем фильтрата, взятый для анализа, в мл (70 мл);
2
V -
объем бензольного раствора ТФА
производного экстракта, в мкл
3
(200 мкл);
V -
объем бензольного раствора ТФА производного экстракта,
внесенный в
4
хроматограф, в мкл.