Утверждены

Минздравом СССР

22 мая 1985 г. N 3891-85

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕПИДОЦИДА НА ОБРАБОТАННЫХ ИМ РАСТЕНИЯХ

ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

 

    Краткая  характеристика  препарата.  Лепидоцид - бактериальный

инсектицидный  препарат  для  борьбы  с листогрызущими насекомыми.

Действующим    началом   препарата   служат   споры   и   продукты

жизнедеятельности  бактерий  Bacillus thuringiensis Var. kurstaki.

Он практически не токсичен для теплокровных животных: при введении

в желудок ЛД   для белых мышей превышает 15 г/кг, для белых крыс -

            50

9,7  +/-  1,9 г/кг. Споры в организме теплокровных не прорастают и

не вызывают инфекционного заболевания. Препарат представляет собой

аморфный  порошок кремового цвета со слабым специфическим запахом.

В воде образует нестойкую суспензию.

Принцип метода. В основу определения остаточных количеств лепидоцида на растениях положены реакция взаимодействия антигена из спор микроорганизма с меченными флюоресцеином антителами и выявление спор в люминесцентном микроскопе по специфическому свечению. Использован непрямой иммунофлюоресцентный метод.

    Метрологическая  характеристика  метода.  Предел  обнаружения:

одна  спора  в  50  полях  зрения,  что  соответствует  (при титре

              11                                                 3

лепидоцида  10    спор/г) 0,01 мкг препарата на 1 г пробы, или 10

спор на 1 г пробы. Ошибка метода 15%.

Избирательность метода. Метод специфичен при условии использования иммунных сывороток против спор микроорганизма, активных в разведениях 1:160 - 1:640 и выше.

Реактивы и материалы. Этанол х.ч. Хлорид натрия, 0,85-процентный раствор. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Сухая люминесцентная ослиная сыворотка против глобулинов кролика производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва. Специфическая иммунная сыворотка кролика против спор.

    Приборы,  аппаратура,  посуда.  Люминесцентный микроскоп марки

МБИ-15  или  другой  аналогичный.  Объект-микрометр.  Центрифуга с

                            -1

частотой  вращения  12  мин.  .  Термостат  на  37 °C. Аппарат для

встряхивания.  Колбы.  Пробирки  бактериологические.  Чашки Петри.

Предметные стекла. Микропипетки.

    Подготовка  к  анализу.  Приготовление специфических сывороток

против  спор  Bacillus  thuringiensis Var. kurstaki. Для получения

специфической  иммунной  сыворотки  проводят  иммунизацию кроликов

однократной  инъекцией  в область подколенного лимфатического узла

суспензии спор чистой культуры, прогретой в течение 1 ч на кипящей

                       9

водяной бане, в дозе 10  микробных клеток на животное. Через месяц

кроликов  реиммунизируют  второй однократной инъекцией антигена из

спор  в  область  подколенного  лимфатического узла в той же дозе.

Спустя  месяц  после  реиммунизации  проверяют  титр  сыворотки  в

непрямой  реакции  иммунофлюоресценции.  При  титре не менее 1:160

получают сыворотку в нужном количестве и используют для проведения

анализа. Сыворотки консервируют мертиолатом в соотношении  1:10000

или подвергают лиофильному высушиванию.

    Определение  титра специфической иммунной сыворотки. Из чистой

культуры  или  из  товарной  формы препарата готовят взвесь спор в

                                              7

физиологическом  растворе  в  концентрации  10   спор  в  1 мл (из

препарата готовят суспензию в разведении 1:1000).

На обезжиренные сухие предметные стекла наносят по капле взвеси и готовят из нее мазки, равномерно распределяя каплю. После подсушивания на воздухе мазки фиксируют этанолом в течение 30 мин., обрабатывают иммунной сывороткой в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. Далее препараты обрабатывают люминесцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика, как описано ниже, просматривают в люминесцентном микроскопе и оценивают реакцию по интенсивности свечения оболочки спор.

Для контроля иммунологической специфичности готовят три контрольных препарата: мазок обрабатывают физиологическим раствором вместо иммунной кроличьей сыворотки; нормальной кроличьей сывороткой; только люминесцирующей антивидовой сывороткой.

За титр сыворотки принимают ее максимальное разведение, при котором еще отмечается четкое, "полыхающее" зеленое свечение оболочки спор. В контрольных мазках свечение оболочки спор отсутствует. Для анализа используют сыворотки, имеющие титр не менее 1:160. Рабочим разведением служит разведение, равное 1/2 титра, т.е. 1:80.

Отбор проб. Пробы отбирают в стерильные бумажные пакеты, сохраняют в прохладном месте при температуре не выше 5 °C и анализируют не позднее 5 - 6 дней.

    Ход  анализа. Для анализа 1 г листьев измельчают с соблюдением

правил асептики, добавляют 15 - 20 мл стерильного физиологического

раствора  и  встряхивают  в колбе на шуттель-аппарате в течение 20

мин.  Смыв  фильтруют  через  два  слоя  стерильной марли и ваты и

                                                               -1

центрифугируют  20  мин.  при  частоте  вращения  12  тыс. мин.  .

Надосадочную  жидкость  сливают,  осадок  ресуспендируют в 0,01 мл

физиологического  раствора.  На  предметные стекла наносят 0,01 мл

суспензии  и  равномерно  распределяют  ее  на площади в 1 кв. см.

Препараты  подсушивают  на  воздухе  и  фиксируют этанолом 30 мин.

Затем    наносят   иммунную   сыворотку   против   спор   Bacillus

thuringiensis  Var.  kurstaki  в  рабочем разведении и помещают во

влажную  камеру  на  20 мин. при температуре 37 °C. Влажную камеру

создают   путем   помещения  в  чашку  Петри  фильтра,  смоченного

физиологическим раствором.

По истечении времени инкубации препараты промывают 1 - 2 мин. проточной водой, высушивают на воздухе, а затем обрабатывают ослиной сывороткой против глобулинов кролика в ее рабочем разведении и оставляют в контакте с ней в течение 20 мин. во влажной камере при 37 °C. Затем препараты промывают водой 1 - 2 мин., высушивают на воздухе и просматривают в люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом 90 x 1,25 и окуляром 4x, используя нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

Одновременно готовят контрольные препараты из взвеси лепидоцида 1:1000 на физиологическом растворе и из проб, взятых на необработанных участках, которые обрабатывают по той же схеме.

Для анализа плодов (например, яблок) исследования проводят следующим образом: целый плод взвешивают, заливают определенным объемом стерильного физиологического раствора, достаточного для полного смачивания. Смыв проводят путем встряхивания сосуда с пробой на шуттель-аппарате в течение 20 мин. Смыв фильтруют, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, ресуспендируют осадок в 0,1 мл физиологического раствора, готовят препарат на предметном стекле и обрабатывают его, как указано выше.

Обработка результатов анализа. С помощью микрометра измеряют площадь поля зрения микроскопа при выбранном для работы увеличении. При использовании объектива 90 x 1,25 и окуляра 4x она равна 0,02 кв. мм.

На каждом мазке под иммерсией просматривают 50 полей зрения, в которых подсчитывают все споры, имеющие яркое, "полыхающее" зеленое свечение. Вычисляют среднее значение количества спор в одном поле зрения. Число спор в 1 кг пробы вычисляют по формуле:

 

                             1000aSV

                         X = -------,

                              V S M

                               1 1

 

    где:

    a - число спор в одном поле зрения;

    S  - площадь мазка  на предметном стекле, по условиям методики

100 кв. мм;

    S   -  площадь одного поля зрения. При использовании объектива

     1

90 x 1,25 и окуляра 4x она равна 0,02 кв. мм;

    V  -  разведение,  равно 0,1,  т.к.  осадок  ресуспендируют  в

0,1 мл;

    V   -  объем  суспензии,  нанесенной  на  стекло.  По условиям

     1

методики он равен 0,01 мл;

    M - масса пробы, г;

    1000 - коэффициент для пересчета граммов в кг.

    С учетом значений известных величин формула упрощается:

 

                                            8

                   100 x 0,1 x 1000 x a   10  x a

               X = -------------------- = -------.

                     0,01 x 0,02 x M       2 x M

 

Требования безопасности. Соблюдаются общие меры безопасности при работе с химическими реактивами и рекомендуемые для работы с условно-патогенными микроорганизмами: предупреждение загрязнения проб и соблюдение правил личной гигиены.