Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

22 мая 1985 г. N 3891-85

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕПИДОЦИДА НА ОБРАБОТАННЫХ

ИМ РАСТЕНИЯХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

 

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Срок действия временных методических указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками Госагропрома СССР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И. и Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.

 

1. Характеристика анализируемого инсектицида

 

Лепидоцид - бактериальный инсектицидный препарат для борьбы с листогрызущими насекомыми. Действующим началом препарата служат споры и продукты жизнедеятельности бактерий Bacillus thuringiensis Var. kurstaki.

    Лепидоцид  практически  не  токсичен  для  теплокровных  животных:  при

введении  в желудок ЛД   для белых мышей превышает 15 г/кг, для  белых крыс

                      50

равна 9,7 +/- 1,9 г/кг. Споры Bac. thuringiensis Var. kurstaki  в организме

теплокровных не прорастают и не вызывают инфекционного заболевания.

Концентрированные суспензии (1 - 5%) лепидоцида оказывают слабое кожно-раздражающее и кожно-сенсибилизирующее действие. В рабочих концентрациях (0,1%) суспензия лепидоцида раздражающим действием не обладает.

Препарат представляет собой аморфный порошок кремового цвета, имеющий слабый специфический запах. В воде образует нестойкую суспензию.

 

2. Методика определения лепидоцида

иммунофлюоресцентным методом

 

2.1.1. Принцип метода

В основу определения остаточных количеств лепидоцида на растениях положена реакция взаимодействия антигена из спор микроорганизма с мечеными флюоресцеином антителами и выявления спор в люминесцентном микроскопе по специфическому свечению. Использован непрямой иммунофлюоресцентный метод.

2.1.2. Метрологическая характеристика

    Предел обнаружения: одна спора  в 50 полях  зрения,  что  соответствует

                        11                                                3

(при титре лепидоцида 10   спор/г) 0,01 мкг препарата на 1 г пробы  или 10

спор  на  1 г  пробы. Среднее  значение определения спор - 83,6%  при  пяти

исследованных  параллельных  пробах,  среднее  квадратическое  отклонение -

6,8%. Доверительный интервал среднего при Р = 0,95 соответствует +/- 17,4%.

2.1.3. Избирательность метода

Метод специфичен при условии использования иммунных сывороток против спор микроорганизма, активных в разведении 1:160 - 1:640 и выше.

 

2.2. Реактивы и материалы

 

Этанол, 96%, ТУ 6-09-1710-77; физиологический раствор (0,85% раствор хлористого натрия); мертиолат; нефлюоресцирующее иммерсионное масло; сухая люминесцентная ослиная сыворотка против глобулинов кролика производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея, г. Москва; специфическая иммунная сыворотка кроликов против спор Bac. thuringiensis Var. kurstaki.

 

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

 

Люминесцентный микроскоп марки МБИ-15У или другой, аналогичный названному; объект-микрометр; центрифуга до 12 тыс. об./мин.; термостат на 37 °С; шуттель-аппарат; колбы; пробирки бактериологические; чашки Петри; предметные стекла; микропипетки.

 

2.4. Подготовка к анализу

 

2.4.1. Приготовление специфических иммунных сывороток против спор Bacillus thuringiensis Var. kurstaki

    Для  получения  специфической  иммунной  сыворотки проводят иммунизацию

кроликов  однократной инъекцией в область подколенного  лимфатического узла

суспензии  спор  чистой  культуры  Bacillus  thuringiensis  Var.  kurstaki,

                                                                          9

прогретой  в  течение  одного  часа  на  кипящей  водяной  бане, в дозе 10

микробных  клеток  на  животное. Через месяц кроликов реиммунизируют второй

однократной   инъекцией   антигена   из   спор   в   область   подколенного

лимфатического  узла  в  той  же  дозе.  Спустя  месяц  после реиммунизации

проверяют титр сыворотки в непрямой реакции иммунофлюоресценции. При титре

не  менее  1:160  получают  сыворотку в нужном количестве и используют  для

проведения   анализа.  Сыворотки  консервируют  мертиолатом  в  соотношении

1:10000 или подвергают лиофильному высушиванию.

    2.4.2. Определение титра специфической иммунной сыворотки

    Из чистой культуры или из товарной формы препарата готовят взвесь  спор

                                            7

в физиологическом растворе в концентрации 10  спор/мл (из препарата готовят

суспензию в разведении 1:1000).

На сухие обезжиренные предметные стекла наносят по капле взвеси и готовят из нее мазки, равномерно распределяя каплю. После подсушивания на воздухе мазки фиксируют этанолом в течение 30 минут, обрабатывают иммунной сывороткой в разведении 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. Далее препараты обрабатывают люминесцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика, как описано ниже, просматривают в люминесцентном микроскопе и оценивают реакцию по интенсивности свечения спор.

Для контроля иммунологической специфичности готовят контрольные препараты:

а) обработанные только флюоресцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика;

б) обработанные физиологическим раствором вместо иммунной сыворотки;

в) обработанные нормальной кроличьей сывороткой вместо иммунной.

За титр сыворотки принимают ее максимальное разведение, при котором еще отмечается четкое, "полыхающее" зеленое свечение спор. В контрольных мазках свечение спор отсутствует. Для анализа используют сыворотки, имеющие титр не менее 1:160. Рабочим разведением служат разведения, равные 1/2 титра, т.е. 1:80.

 

2.5. Отбор проб

 

Пробы для анализа отбирают согласно Унифицированным правилам отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденным Зам. Главного государственного санитарного врача СССР 21.06.1979 за N 2051-79.

Пробы отбирают в стерильные бумажные пакеты, сохраняют в прохладном месте (не выше +5 °С) и анализируют не позднее чем через 5 - 7 дней.

 

2.6. Проведение анализов

 

Для анализа 1 г листьев измельчают с соблюдением правил стерильности, добавляют 15 - 20 мл стерильного физиологического раствора и встряхивают в колбе на шуттель-аппарате в течение 20 минут. Смыв фильтруют через два слоя стерильной марли и ваты и центрифугируют при 12 тыс. об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 0,1 мл физиологического раствора. На предметные стекла наносят 0,01 мл суспензии и равномерно распределяют ее на площади 1 кв. мм. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют этанолом 30 минут. Затем наносят иммунную сыворотку против Bacillus thuringiensis Var. kurstaki в рабочем разведении и помещают во влажную камеру при температуре 37 °С на 20 минут. Влажную камеру создают путем помещения в чашку Петри фильтра, смоченного физиологическим раствором.

По истечении времени инкубации препараты промывают 1 - 2 минуты проточной водой, высушивают на воздухе, затем обрабатывают ослиной сывороткой против глобулинов кролика в ее рабочем разведении и оставляют в контакте с ней в течение 20 минут во влажной камере при 37 °С. Далее препараты промывают проточной водой 1 - 2 минуты, высушивают на воздухе и просматривают в люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом 90 х 1,25 и окуляр х4.

Одновременно готовят контрольные препараты из взвеси лепидоцида 1:1000 на физиологическом растворе и из проб, взятых на необработанном участке, которые обрабатывают по той же схеме.

Для анализа проб плодов (например, яблок) исследования проводят следующим образом: целый плод взвешивают, заливают определенным объемом стерильного физиологического раствора, достаточным для полного смачивания. Смыв проводят путем встряхивания сосуда с пробой на шуттель-аппарате в течение 20 минут. Смыв фильтруют, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в 0,1 мл физиологического раствора, готовят препараты на предметных стеклах и обрабатывают их сыворотками, как указано выше.

 

2.7. Расчет

 

С помощью объект-микрометра измеряют площадь поля зрения микроскопа при выбранном для работы увеличении. При использовании объектива 90 х 1,25 и окуляра х4 она равна 0,02 кв. мм.

На каждом мазке под иммерсией рассматривают 50 полей зрения, в которых подсчитывают все споры, имеющие яркое "полыхающее" зеленое свечение. Вычисляют среднее значение количества спор в одном поле зрения.

    Расчет концентрации спор в 1 г листьев проводят по формуле:

 

                                 а х S х V

                            Х = -----------,

                                V  х S  х М

                                 1    1

 

    где:

    Х - число спор в навеске;

    а - число спор в одном поле зрения;

    S - площадь   мазка   на  предметном  стекле.  По  условиям  методики -

1 кв. см, т.е. 100 кв. мм;

    S  - площадь одного поля зрения. При использовании объектива  90 х 1,25

     1

и окуляра х4 она равна 0,02 кв. мм;

    V - разведение = 0,1, т.к. осадок ресуспендируют в 0,1 мл;

    V  - объем  суспензии,  нанесенной  на  стекло. По условиям методики он

     1

равен 0,01 мл;

    М - масса пробы в граммах.

    С учетом значений известных величин формула принимает такой вид:

 

                                  5

          а х 100 х 0,1     а х 10

    Х = ----------------- = -------, спор в 1 г пробы.

        0,01 х 0,02 х 1,0      2

 

    Пример:   масса   пробы  (М) = 1,0  грамма обработана,  как  описано  в

методике, полученный осадок ресуспендирован в объеме (V) 0,1 мл, на площадь

(S) 100  кв.  мм   предметного  стекла  нанесено  (V )  0,01 мл  суспензии.

                                                    1

Полученный  препарат  обработали  по  методике   (п. 2.6).  При   просмотре

препарата  в люминесцентном  микроскопе  количество  спор в 50 полях зрения

составило 2192. Отсюда:

 

        SUM 50   2192

    а = ------ = ---- = 43,84.

          50      50

 

    Подставляя в формулу известное значение, получаем:

 

                                                    5

         а х S х V    43,84 х 100 х 0,1   43,84 х 10              5

    Х = ----------- = ----------------- = ----------- = 21,92 х 10  =

        V  х S  х М   0,01 х 0,02 х 1,0        2

         1    1

 

               6

    = 2,19 х 10 , спор в 1 грамме.

 

    Расчет концентрации спор на плодах проводят по формуле:

 

                            а х S х V х 1000

                        Х = ----------------,

                              V  х S  х М

                               1    1

 

    где значения а, S, S , V, V , М - те же, что  и  в формуле для листьев,

                        1      1

1000  -  перерасчетный  коэффициент   для   выражения   результата   на  кг

обработанного  продукта.  После  подстановки  известных  значений   формула

принимает вид:

 

                                           8

                                     а х 10

                                 Х = -------, спор/кг.

                                       2М

 

Методику разработали:

Мельникова Е.А., Пляченко Е.А. (ВНИИГИНТОКС).