Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
10 октября 1985 г. N 3940-85
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ
ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА (ВОМИТОКСИНА) В ЗЕРНЕ И ЗЕРНОПРОДУКТАХ
Методические указания предназначены для
лабораторий санитарно-эпидемиологических станций и институтов гигиенического
профиля при контроле за загрязнением зерна и зернопродуктов дезоксиниваленолом.
Разработаны в лаборатории энзимологии
питания и лаборатории гигиенических исследований
импортируемых пищевых продуктов Института питания АМН СССР.
Дезоксиниваленол (вомитоксин) - микотоксин,
продуцируемый различными видами микроскопических
грибов рода Fusarium. Наиболее распространенными
продуцентами являются грибы F. graminearum и F. culmorum, вызывающие корневую гниль и ряд других микозов
растений.
Дезоксиниваленол - один из наиболее часто обнаруживаемых микотоксинов
из группы трихотеценовых, которые являются причиной
тяжелых алиментарных токсикозов, характеризующихся геморрагическим синдромом,
отказом от пищи, рвотой, поражением кроветворных и иммунокомпетентных органов.
Загрязнение дезоксиниваленолом встречается в
пораженных грибами Fusarium пшенице, кукурузе, ячмене
и других зерновых.
В СССР установлена
временная ПДК на содержание дезоксиниваленола в
сильных и твердых сортах пшеницы на уровне 1,0 мг/кг, в остальной пшенице - 0,5
мг/кг.
Дезоксиниваленол (C
H O )
- бесцветное кристаллическое вещество с
15 20 6
молекулярной массой
296, имеет слабо выраженный максимум поглощения УФ-
света при
длине волны 219 нм (эпсилон 4500),
не обладает прямой
флуоресценцией.
Температура плавления 151 - 153 °C. Дезоксиниваленол
хорошо
растворим в спиртах,
ацетонитриле,
этилацетате, не растворим в гексане и
бензоле.
В основе предлагаемого метода определения
дезоксиниваленола лежит визуальная оценка
интенсивности флуоресценции при тонкослойной хроматографии (ТСХ) после
обработки пластинки спиртовым раствором хлористого алюминия.
Предел обнаружения метода 0,2 мг/кг,
относительное стандартное отклонение 0,25 - 0,3. Степень извлечения
добавленного к образцу стандарта дезоксиниваленола -
90%. Продолжительность анализа - 2 часа.
При использовании высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектором предел
обнаружения составляет 0,05 мг/кг, относительное стандартное отклонение 0,05 -
0,09.
Метод включает следующие этапы:
- экстракцию образца смесью ацетонитрил-вода (84:16);
- очистку экстракта с помощью колоночной
хроматографии (КХ) на активированном угле и окиси алюминия;
- разделение, идентификацию и определение
содержания дезоксиниваленола с помощью одномерной ТСХ
с визуальной оценкой интенсивности флуоресценции или с помощью ВЭЖХ на
силикагеле с УФ-детектором при длине волны 224 нм (для быстрого выявления образцов, загрязненных дезоксиниваленолом на уровне, превышающем ПДК);
- подтверждение наличия и количественное
определение дезоксиниваленола с помощью двумерной ТСХ
с визуальной оценкой интенсивности флуоресценции.
Окончательное заключение о наличии и
уровне загрязнения образца дезоксиниваленолом
принимается только на основе данных двумерной ТСХ.
Методические указания предназначены для
лабораторий санитарно-эпидемиологических станций и институтов гигиенического
профиля при контроле за загрязнением зерна и зернопродуктов (мука, крупы) дезоксиниваленолом.
ОБОРУДОВАНИЕ И
МАТЕРИАЛЫ
1. Аппарат для встряхивания проб типа
АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.
2. Ротационный испаритель с ловушкой
ИР-1М или аналогичный.
3. Мельница лабораторная электрическая
ЭМ-3А по ТУ 46-22-236-79.
4. Прибор для флуоресцентного анализа
витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа
ОЛД-41.
5. Жидкостной хроматограф "Алтекс", модель 336, или другой хроматограф с
аналогичными параметрами; колонка и предколонка с
силикагелем типа "Ультрасфера-Si"
с размером частиц 5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки
- 4,5 см, внутренний диаметр - 0,46 см; ультрафиолетовый детектор "Кратос", модель SF-757 или другой детектор с
аналогичными параметрами.
6. Микрошприц
МШ-10 на 10 мкл.
7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми
крышками.
8. Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15 х 15 см или 20 х 20 см, ЧССР.
9. Колбы плоскодонные конические на 250
мл с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-74.
10. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой
пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.
11. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5,
тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.
12. Распылитель стеклянный с грушей.
13. Стандартный раствор дезоксиниваленола в смеси бензол-ацетонитрил
(5:1) с концентрацией 25 нг/мкл
(по поводу получения стандартного раствора обращаться в Институт питания АМН
СССР).
14. Ацетонитрил
"ч" по ТУ 6-09-3534-74.
15. Ацетон "чда"
по ГОСТ 2603-79.
16. Эфир диэтиловый
"мед" по ГОСТ 6265-52.
17. Кислота уксусная "чда" по ГОСТ 61-75.
18. Бензол "чда"
по ГОСТ 5955-75.
19. Гексан
"ч" по ТУ 6-09-3375-78.
20. Изо-пропиловый спирт (пропанол-2) "хч" по ТУ 6-09-402-76.
21. Спирт этиловый - ректификат, ТУ
6-09-1710-77.
22. Хлороформ для наркоза или по ГОСТ
3610-51.
23. Алюминий окись нейтральная для
хроматографии по Брокману П,
"Реанал" номер по каталогу 01125 (Венгрия)
или алюминий окись для хроматографии по ТУ 6-09-3916-75.
24. Уголь активированный Р.72.270.3.
25. Колонка стеклянная хроматографическая 220 х 15 мм.
26. Метанол "чда"
по ГОСТ 6995-77.
1. ЭКСТРАКЦИЯ
При отборе пробы для анализа следует
руководствоваться требованиями ГОСТа 12430-66 "Сельскохозяйственная
продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе".
Отобранную пробу измельчают в течение 1 - 2 мин. в лабораторной мельнице или
кофемолке. Навеску 25 г измельченного зерна или муки помещают в плоскодонную
коническую колбу на 250 мл, добавляют 20 мл воды и затем 105 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания проб
в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр
в мерный цилиндр.
2. ОЧИСТКА
ЭКСТРАКТА
В стеклянную хроматографическую
колонку на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г окиси алюминия и сверху -
слой 0,75 г активированного угля, предварительно растертого в ступке. Над слоем
угля помещают кусочек ваты. Наливают в колонку 25 мл экстракта, соответствующие
5 г исходного образца (при анализе кукурузы наливают 15 мл экстракта,
соответствующие 3 г исходного образца). Отбирают элюат
и, не давая колонке просохнуть, добавляют еще 10 мл смеси ацетонитрил-вода
(84:16). Соединенные элюаты фильтруют через бумажный
складчатый фильтр в грушевидную колбу на 50 мл, бумажный фильтр промывают 5 -
10 мл изо-пропилового спирта
в ту же колбу. Фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5 - 7 мл.
Добавляют 20 мл изо-пропилового
спирта и повторно упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе
после упаривания не должен содержать капель воды. Остаток растворяют в 200 мкл смеси хлороформ-ацетонитрил
(4:1) - раствор А.
3. ОБНАРУЖЕНИЕ И
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА С ПОМОЩЬЮ ТСХ
На пластинке "Силуфол"
проводят тонкую карандашную линию в 1,5 - 2 см от нижнего края пластинки. На
эту линию на расстоянии 2 см друг от друга наносят с помощью микрошприца 2, 5, 10 и 20 мкл
раствора А. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию
наносят 2, 4, 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола (50, 100 и 150 нг
дезоксиниваленола соответственно). Пластинку помещают
в камеру для ТСХ и развивают в системе хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт
(78:22:10) на расстояние 10 см. Пластинку извлекают, сушат на воздухе 3 - 4
мин. и опрыскивают 20-процентным раствором хлористого алюминия в этиловом
спирте. Пластинку нагревают в сушильном шкафу в течение 5 - 7 мин. при 105 °С, затем рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей
флуоресценцией и хроматографической подвижностью (Rf) 0,4 - 0,5. Наличие в экстракте пятен, соответствующих
по цвету флуоресценции и хроматографической
подвижности стандарту дезоксиниваленола,
свидетельствует о загрязнении образца дезоксиниваленолом.
Для количественного определения
сравнивают интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта
дезоксиниваленола с интенсивностью флуоресценции его
пятен в образце, приблизительно оценивая количество нг
дезоксиниваленола в нанесенных на пластинку объемах
раствора А.
Концентрацию дезоксиниваленола
в образце рассчитывают по формуле:
V x m
1
C = --------- мг/кг,
V x
5000
2
где:
V -
объем раствора А в мкл (200 мкл),
1
V -
объем раствора А, нанесенный на пластинку, в мкл,
2
m
- количество нг дезоксиниваленола в V мкл раствора А, оцененное
2
визуальным
сравнением со стандартом на ТСХ-пластинке.
Если
интенсивность флуоресценции пятна дезоксиниваленола
в экстракте
выше интенсивности флуоресценции пятна дезоксиниваленола, соответствующего
6 мкл стандартного раствора, то следует разбавить раствор А, т.е. увеличить
объем V , внеся
соответствующие коррективы в расчетную формулу.
1
4. ОБНАРУЖЕНИЕ И
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА С ПОМОЩЬЮ ВЭЖХ
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза гексан-изопропиловый спирт-вода (75:25:1,5), скорость
подвижной фазы 1,2 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители,
фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. УФ-детектор устанавливается на длину волны 224 нм, шкала чувствительности 0,005. Входное напряжение
самописца 10 мВ.
Для калибровки прибора в инжектор с
помощью микрошприца вводят 2 и 4 мкл
стандартного раствора, что соответствует 50 и 100 нг дезоксиниваленола. Для каждого количества стандарта
определяют высоту пика на хроматограмме. При
описанных выше условиях ВЭЖХ время выхода пика дезоксиниваленола
составляет от 12 до 14 мин. в зависимости от изменений в составе подвижной
фазы.
В
инжектор хроматографа вводится 10
мкл раствора А. При наличии пика,
совпадающего по
времени выхода со
стандартом, определяют его
высоту
(h ).
обр
Расчет концентрации дезоксиниваленола
в образце проводят по формуле:
V x m x h
1 обр
C = ---------------,
мг/кг,
V x 5000 x h
2 ст
где:
V -
объем раствора А в мкл (200 мкл),
1
V -
объем раствора А, внесенный в хроматограф, в мкл (10 мкл),
2
m - масса стандарта дезоксиниваленола,
введенная в хроматограф, в нг,
h -
высота пика, соответствующая данной массе стандарта, в мм,
ст
h
- высота пика дезоксиниваленола из образца, в мм.
обр
Если
пик дезоксиниваленола в
образце выходит за
пределы шкалы
самописца, анализ
проводят повторно после разбавления раствора
А смесью
хлороформ-ацетонитрил (4:1), т.е. после увеличения объема V .
1
5. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ
НАЛИЧИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА С ПОМОЩЬЮ ДВУМЕРНОЙ ТСХ
Пластинку "Силуфол"
размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля, согласно
рис. 1 (не приводится). В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев
пластинки наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора А. В правом верхнем и левом нижнем углах
пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят 2, 3, 4 и 5, 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола
соответственно. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью
эфир-метанол-вода-бензол (90:3:0,5:3) и развивают пластинку в первом
направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии,
проведенной в 4 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на
воздухе 5 мин. Затем проводят развитие пластинки во 2-ом направлении в системе
хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт-уксусная кислота
(78:22:10:1:3). После достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной
в 4 см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе.
Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола
проводят аналогично п. 3.
* * *
По вопросам практического внедрения
метода обнаружения, идентификации и определения содержания дезоксиниваленола
в зерне и зернопродуктах следует обращаться в
Институт питания АМН СССР (Москва, 109240, Устьинский
проезд, 2/14, тел. 227-88-54).