Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
21 ноября 1985 г. N 4038-85
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АКТЕЛЛИКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
(Дополнение к N 2085-79)
Настоящие Методические указания
предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и
научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных,
агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома СССР и
лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных
количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней
среде.
Срок действия временных методических
указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов.
Методические указания апробированы и
рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по
химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками
Госагропрома СССР.
Методические указания согласованы и одобрены
отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И. и
Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидимиологическом
управлении Минздрава СССР.
1. Краткая
характеристика пестицида
Актеллик (пиримифос-метил), его активное вещество -
0,0-диметил-0-(2-диетиламино-6-метилпиримидил-4)-тиофосфат.
Структурная формула:
H C
3
//\ OP(OCH )
\//
\ /││ 3 2
│
││ S
│
││
N\\
/N
\\/
│
C H -N-C H
2 5
2 5
Эмпирическая формула: C H O N
PS.
11 20 3 3
Молекулярная масса: 305,35.
Актеллик представляет собой светло-желтую жидкость, температура плавления 15 -
18 °С. Разлагается сильными кислотами, щелочами, а также при температуре 100
°С.
Актеллик хорошо
растворяется во многих органических растворителях и
-4
слабо в
воде. Давление пара 1,1 х 10
мм рт. ст. при 30 °С. Показатель
25
преломления -
n = 1,527.
Применяется в виде порошка, содержащего
2% актеллика; 25-процентного концентрата эмульсии -
"Актеллик 25 ЕС" (jF
2520); 50-процентного концентрата эмульсии - "Актеллик
50 ЕС" (jF 2764).
Актеллик эффективен против вредителей хлебных злаков;
рекомендован для борьбы с эктопаразитами птиц. Он отличается быстрым
проявлением инсектицидной активности при сравнительно невысокой норме его
расхода.
Актеллик мало токсичен. При внесении внутрь крысам
ЛД - 2050 мг/кг.
50
При нанесении
на кожу ЛД - 2000 мг/кг. Он не кумулируется
в жировых
50
тканях. МДУ актеллика в мясе и
яйцах кур не установлен.
Допустимая суточная доза актеллика для человека установлена на уровне 0,01 мг/кг
массы тела в сутки, что составляет примерно 0,5 - 0,7 мг/человека/сутки (данные
ФАО/ВОЗ).
2. Методика
определения актеллика
2.1. Основные
положения
2.1.1. Принцип метода
Метод основан на извлечении актеллика из исследуемой пробы смесью ацетона и воды (1:1),
очистке экстракта и определении методом хроматографии в тонком слое с энзимным
проявлением либо методом газожидкостной хроматографии.
2.1.2. Метрологическая характеристика
метода (приведена в таблице).
Таблица
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА
┌─────────────┬────────┬───────────┬─────────┬─────────┬───────┬──────────┐
│ Метод
│Наимено-│Диапазон │
Нижний │ Среднее │Стан- │Довери- │
│ анализа
│вание
│определяе- │ предел │значение
│дартное│тельный │
│ │объекта │мых концен-│обнаруж.,│определ.,│откл. │интервал │
│ │ │траций,
мкг│ мг/кг │
% │ │среднего, │
│ │ │ │ │ │ │% │
├─────────────┼────────┼───────────┼─────────┼─────────┼───────┼──────────┤
│Энзимо-хрома-│Мясо кур│0,005
- 0,1│0,02 │78 │4,0 │78 +/- 6,1│
│тографический│Яйца кур│-"- │-"- │65 │3,1 │65 +/- 5,2│
│ │ │ │ │ │ │ │
│Газожидкост-
│Мясо кур│0,0001 - │0,001 │80 │2,6 │80 +/- 3,2│
│ная хромато- │Яйца кур│0,002 │-"- │68 │3,2 │68 +/- 5,4│
│графия │ │ │ │ │ │ │
└─────────────┴────────┴───────────┴─────────┴─────────┴───────┴──────────┘
2.2. Реактивы и
растворы
Ацетон, ч.д.а.,
ГОСТ 2603-79.
н-Гексан, ч.,
ТУ 6-09-3375-78.
Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.
Бром, ч., ГОСТ 4109-74.
Силикагель марки КСК, ГОСТ 3956-77,
дробленый и просеянный через сито 100 меш, или пластинки "Силуфол".
Кальций
сернокислый (CaSO х 2H O),
ч.д.а., ГОСТ 3210-77, просушенный
4 2
в шкафу при
температуре 160 °С в течение 6 часов.
Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ 6-09-07-1156-78, или фирмы
"Хемапол" (Чехословакия).
Буферный раствор (рН = 8,69). К 2,1 мл
ортофосфорной кислоты прибавляют 2,3 мл уксусной и 2,47 г борной кислот,
доводят дистиллированной водой до 1 л. Для получения буфера с рН = 8,69 к 100
мл указанной смеси прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра.
Уксусная кислота, х.ч.,
ГОСТ 18290-72.
Ортофосфорная кислота, х.ч., ГОСТ 6552-80.
Борная кислота, х.ч.,
ГОСТ 9656-75.
Натрий серноватистокислый,
ч.д.а., 0,1 М водный раствор.
Калий железосинеродистый, х.ч., ГОСТ 4206-75, 1,6-процентный водный раствор.
Калий железистосинеродистый,
х.ч., ГОСТ 4207-75, 2-процентный водный раствор.
Этиловый спирт, 96%, ТУ 6-09-1710-77.
Ферментный препарат получают из печени
крупного рогатого скота. Свежую, однократно замороженную и сохраняемую в
дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев.
Для приготовления ферментного раствора 1
г печени гомогенизируют с 9 мл буферного раствора и фильтруют через вату. К 1
мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора. Этот раствор
используют для опрыскивания пластинок. Раствор готовят непосредственно перед
обработкой.
Основной стандартный раствор
"А" актеллика, концентрация 100 мкг/мл.
Рабочие стандартные растворы
"Б" - 5,0 мкг/мл и "В" - 1,0 мкг/мл готовят разбавлением
основного стандартного раствора в ацетоне.
Проявляющий раствор. 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл
буферного раствора рН = 8,69, 2 мл железосинеродистого и 2 мл железистосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор
готовят непосредственно перед обработкой пластинок.
2.3. Приборы и
посуда
Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76.
Воронки фильтровальные, ГОСТ 8613-75.
Воронки делительные емкостью 1000 мл, 500
мл, ГОСТ 8613-75.
Испаритель ротационный с набором колб,
тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.
Камера для хроматографирования,
ГОСТ 10585-75.
Камера для опрыскивания, ТУ 25-11-430-70.
Колбы мерные емкостью 25, 50, 100, 1000
мл, ГОСТ 1770-74.
Колба Бунзена, ГОСТ 6514-75.
Пластинки стеклянные, 9 х 12 см.
Пробирки мерные на шлифах емкостью 5 - 10
мл, ГОСТ 1770-74.
Пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл, ГОСТ
1770-74.
Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-74.
Микрошприц емк. 10 мкл, МШ-10, ТУ 5Е-2.833.024, или
микропипетка на 0,1 мл, ГОСТ 1770-74.
Ступка керамическая, d = 10 см.
Шкаф сушильный, ТУ 64-1-1411-76.
Хроматограф "Цвет-164" с
пламенно-фотометрическим детектором (или "Цвет-106" с термоионным
детектором).
2.4. Подготовка к
определению
2.4.1. Приготовление пластинок
Для приготовления пластинок берут 35 г
силикагеля "КСК", 2 г сернокислого кальция и 90 мл дистиллированной
воды. Силикагель с гипсом растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и
размешивают до образования однородной массы. 10 г суспензии наносят на
пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Сушат пластинки в
горизонтальном положении в течение 18 - 20 часов при комнатной температуре,
хранят в эксикаторе.
2.4.2. Подготовка проб
Отбор проб производится в соответствии с
"Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции,
продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утв. N 2051-79 от
21.09.1979.
2.5. Проведение
определения
2.5.1. Экстракция и очистка экстракта
Навеску анализируемого объекта (20 г мяса
кур или 5 г желтка яйца) тщательно измельчают (желток перемешивают) и помещают
в коническую колбу, приливают 20 мл смеси ацетона и воды (1:1) и экстрагируют в
течение 1 часа при перемешивании пробы. Экстракцию повторяют дважды по 30 мин.
в тех же условиях. Фильтруют пробы через бумажный фильтр (синяя лента) на
воронке Бюхнера либо через стеклянный фильтр Шотта N 4. Экстракт помещают в холодильник на 2 часа.
Фильтруют экстракт, фильтр промывают смесью ацетона и воды (1:1). Объединяют
фильтраты, прибавляют дистиллированную воду (100 мл). Проводят переэкстракцию пестицида в н-гексан.
Для этого к ацетоно-водному экстракту добавляют 30 -
40 мл н-гексана и встряхивают 2 - 3 мин. После
разделения слоев гексановый отделяют, а к ацетоно-водному прибавляют такое же количество н-гексана, как указано выше. Встряхивают снова 2 - 3 мин. и
слои разделяют. Переэкстракцию в н-гексан повторяют еще раз. Гексановые
экстракты объединяют, сушат безводным сернокислым натрием и упаривают до
небольшого объема (1 - 2 мл) на ротационном испарителе. Из данного объема
аликвотную часть (10 - 30 мкл) наносят на пластинку
или 3 - 5 мкл вводят в газовый хроматограф.
2.5.2. Определение энзимно-хроматографическим методом
На
пластинку, покрытую тонким
слоем силикагеля, или на
пластинку
"Силуфол" на
расстоянии 1,5 см от нижнего и бокового краев наносят 5 - 10
мкл стандартного раствора
актеллика
с концентрацией 5,0
мкг/мл, что
соответствует 0,02 - 0,05 мкг действующего начала. На
расстоянии 1,5 - 2,0
см от точки
нанесения стандартного раствора наносят анализируемую пробу.
Производят хроматографирование в системе растворителей н-гексана + ацетон =
9:1. Сушат
пластинку на воздухе
и активируют парами брома. Для этого
пластинку на
1 мин. помещают в эксикатор,
насыщенный парами брома. После
удаления избытка
брома с пластинки (~ 60 мин.)
производят ингибирование.
Для этого пластинку опрыскивают
свежеприготовленным ферментным раствором и
инкубируют в
течение 40 - 60 мин. в насыщенном
водными парами термостате
при температуре
38 °С. Для увлажнения в термостате ставят чашку
Петри с
водой. После
инкубации пластинку опрыскивают
проявляющим раствором
(индоксилацетат) и снова помещают пластинку в термостат,
нагретый до 38 °С,
на 2
- 3 мин. Актеллик
проявляется в виде белых пятен на голубом фоне с
величиной R = 0,52.
f
Количественное определение производят
путем сравнения площади пятна с наиболее близкой к ней по величине площадью
стандарта.
Содержание препарата в пробе (мг/кг)
рассчитывают по формуле:
А х S х Y х 1000
2
Х =
-----------------,
Р х S х Y
1 1
где:
А - количество препарата в стандарте, мкг;
S -
площадь пятна стандарта, кв. мм;
1
S -
площадь пятна пробы, кв. мм;
2
Y -
объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкг;
1
Y - общий объем экстракта, мл;
Р - масса пробы,
взятой для анализа, г.
2.5.3. Определение методом газожидкостной
хроматографии
Из подготовленного экстракта пробы
отбирают аликвотную часть (3 - 5 мкл) и вводят в
испаритель хроматографа.
Условия хроматографирования:
хроматограф с пламенно-фотометрическим детектором:
стеклянная колонка длиной 100 см и
диаметром 3 мм, заполненная 5% SE-30 на хроматоне
N-AW-ДМСS (0,16 - 0,20 мм). Температура испарителя - 220 °С,
температура колонки - 190 °С;
скорость газа-носителя (азота) - 40
мл/мин.;
скорость водорода - 66 мл/мин.;
скорость воздуха - 120 мл/мин.;
время удерживания актеллика
в указанных условиях - 4 мин. 35 сек.;
8
входное сопротивление - 10 Ом;
-2
шкала множителя - 4 х 10 в;
-10
шкала по току - 4 х 10 А;
скорость движения ленты самописца - 240
мм/ч.
Условия хроматографирования
при использовании хроматографа с термоионным детектором приведены в сборнике
"Методические указания по определению микроколичеств
пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде", ч. XI, 1981 г.,
с. 296 - 303.
Содержание препарата в пробе (мг/кг)
рассчитывают по формуле:
Н х Y х А х Y
2 1
3
Х = ----------------,
Н х Y х Р
1 2
где:
А - количество препарата в стандарте,
мкг/мл;
Н -
высота пика стандарта, мм;
1
Н -
высота пика препарата в пробе, мм;
2
Y -
объем стандартного раствора, введенного в хроматограф, мкл;
1
Y -
объем анализируемого раствора, введенного в хроматограф, мкл;
2
Y -
объем экстракта пробы для анализа, мл;
3
Р - навеска пробы,
г.
2.6. Обработка результатов анализа
приведена в разделах 2.5.2 и 2.5.3.
3. Требования
техники безопасности
Соблюдать требования техники
безопасности, обычно рекомендуемые для работы с органическими растворителями,
бромом.
4. Настоящие
Методические указания подготовлены: Н.И. Киселевой и С.И. Гнед
(ВНИИГИНТОКС, г. Киев).
5. Дополнение
Настоящие
Методические указания рекомендуются в дополнение к "Энзимно-хроматографическому методу определения фосфорорганических
пестицидов в растительных продуктах и биосубстратах",
разработанному М.В. Письменной (ВНИИГИНТОКС, г. Киев), утв. 19 октября 1979 г.
за N 2086-79, и к "Методическим указаниям по определению актеллика в растительном материале, в почве и в воде
хроматографией в тонком слое и на газовом хроматографе", разработанным
Т.М. Петровой, Ю.Б. Андреевым (ВНИИ
защиты растений, г. Ленинград), Красных А.А. (Всероссийский НИИ защиты
растений, пос. Рамонь Воронежской обл.), утв. 19 октября 1979 г. за N 2085-79.
6. Методические
указания апробированы в институтах: Всесоюзный институт защиты растений, г.
Ленинград (Петрова Т.М.); Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии, г.
Москва (Полякова В.Н.).