Утверждаю
Заместитель Главного
государственного санитарного
врача СССР
В.Е.КОВШИЛО
27 марта 1986 г. N 4083-86
ВРЕМЕННЫЕ ГИГИЕНИЧЕСКИЕ НОРМАТИВЫ
И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИСТАМИНА
В РЫБОПРОДУКТАХ <*>
СанПиН 42-123-4083-86
--------------------------------
<*> Данными Нормативами
рекомендуется пользоваться в случаях, когда имеются нарушения условий и сроков
хранения рыбопродукции с целью профилактики пищевых
отравлений гистаминной этиологии, а также в процессе
расследования случаев пищевых отравлений.
Настоящие правила разработаны и
утверждены на основе Положения о государственном санитарном надзоре в СССР (п.
7а), утвержденного Постановлением Совета Министров СССР от 31.05.73 N 361.
Нарушение санитарно-гигиенических и
санитарно-противоэпидемических правил и норм влечет дисциплинарную,
административную или уголовную ответственность в соответствии с
законодательством Союза ССР и союзных республик (ст. 18).
Государственный
санитарный надзор за соблюдением санитарно-гигиенических и
санитарно-противоэпидемических правил и норм государственными органами, а также
всеми предприятиями, учреждениями и организациями, должностными лицами и
гражданами возлагается на органы и учреждения санитарно-эпидемиологической службы
Министерства здравоохранения СССР и министерств здравоохранения союзных
республик (ст. 19) (Основы законодательства Союза ССР и союзных республик о
здравоохранении, утвержденные Законом СССР от 19 декабря 1969 г. и введенные в действие с 1 июля 1970 г.).
В целях охраны здоровья населения СССР
устанавливаются временные гигиенические нормативы и метод определения
содержания гистамина в рыбопродуктах.
Гистамин (бета-имидазолэтиламин
или 2-аминоэтилимидазол) является широко распространенным биогенным амином,
повышенное накопление которого в некоторых продуктах питания при определенных
условиях может служить причиной пищевых отравлений.
N----C--CH --CH
││ ││ 2 |
2
HC CH NH
\ / 2
NH
Гистамин является естественной составной
частью продуктов питания, так как в процессе жизнедеятельности он образуется в
различных тканях животных. Естественное содержание гистамина невелико и не
оказывает неблагоприятного воздействия на организм. Гистамин образуется в
продуктах в результате декарбоксилирования гистидина
при участии ферментов микрофлоры, развивающейся при нарушении условий хранения.
Среди микробов, ответственных за процесс декарбоксилирования
гистидина, отмечают многих представителей семейства Enterobacteriacea
(Echerichia, Enterobacter, Schigella, Salmonella, Proteus) и некоторые виды, принадлежащие к Pseudomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridlum, Vibrio.
Накопление гистамина в рыбе может
происходить в период от вылова до замораживания, особенно, если рыба в этот
период хранится без охлаждения. Возможно накопление гистамина в рыбе при
нарушении цепи холодильного хранения и несоблюдении технологии оттаивания и
сроков хранения перед термической обработкой. В этих случаях в мышечной ткани
некоторых видов рыб, особенно тунцов, скумбрии и некоторых других может
происходить накопление гистамина до токсических уровней. В
подавляющем большинстве случаев зарегистрированные вспышки гистаминовых
отравлений были обусловлены использованием рыбы из семейства скумбриевых,
содержащей большое количество гистамина, и продуктов из нее.
Скрытый период отравления рыбой с
повышенным содержанием гистамина обычно составляет менее одного часа, но может
колебаться в зависимости от индивидуальных различий от 5 мин. до 5 ч. Симптомы гистаминовой интоксикации весьма характерны. Пострадавшие
отмечают резкий или горький (перечный) вкус пищи,
наблюдаются покраснение лица и шеи с чувством жара и общего дискомфорта,
сильные головные боли, слезотечение, боли в глазах, отек слизистой оболочки
носа. Иногда отмечаются нарушения сердечного ритма, жжение в полости рта и
глотки, затруднение глотания. Появляются сыпь на лице и шее, зуд кожи. У части
пострадавших отмечаются желудочно-кишечные расстройства, боли в животе, тошнота,
понос. В тяжелых случаях наблюдаются шок, бронхоспазмы,
удушье и расстройства дыхания.
Предел переносимости гистамина для
взрослого человека составляет 5 - 6 мг/кг веса тела. Токсическая доза находится
в пределах > 100 - 1000 мг/кг продукта и высокотоксичная - свыше 1 г/кг.
Временная предельно допустимая
концентрация гистамина в рыбопродуктах установлена на уровне 100 мг/кг с учетом
практики международного законодательства (Финляндия, Чехословакия, США, Швеция
и др.).
В случае обнаружения гистамина в рыбе,
содержание которого превышает предельно допустимую концентрацию, ее следует
направлять на рыбообрабатывающие предприятия для изготовления рыбопродукции, где по технологии предусматриваются
разбавление (фаршевые изделия) или подсортировка с другими видами рыб
(консервы). При этом среднее содержание гистамина в продуктах, поступающих для
питания, не должно превышать 100 мг/кг массы рыбы.
Метод определения
содержания гистамина в рыбопродуктах
В основе метода определения гистамина
лежит измерение интенсивной флуоресценции производного, полученного при
взаимодействии гистамина с о-фталевым альдегидом.
Предел обнаружения метода - 0,1 мг/кг,
относительное стандартное отклонение - 0,20 - 0,30. Степень извлечения
добавленного к образцу стандарта гистамина - 65 - 85%. Продолжительность
анализа - 3 ч.
Метод включает следующие этапы:
- подготовку образца к анализу;
экстракцию метанолом;
- очистку экстракта с помощью
ионообменной хроматографии;
- построение калибровочной кривой;
- количественное определение гистамина.
Методические рекомендации предназначены
для лабораторий институтов гигиенического профиля и
санитарно-эпидемиологических станций для определения содержания гистамина в
рыбопродуктах.
Оборудование и
материалы
1. Мясорубка по ГОСТ 4025-83Е.
2. Микроразмельчитель
тканей РТ-2 по МРТУ 64.1.-1505-63.
3. Весы технические по ГОСТ 24104-80Е.
4. Весы аналитические по ГОСТ 24104-80Е.
5. Спектрофотометр СПЕКОЛ (Карл Цейсс ИЕНА) с измерительной приставкой для определения
флуоресценции. Светофильтры: первичный лямбда = 365 нм,
вторичный лямбда = 465 нм. Возможно использование
отечественного флуориметра БИАН-130 (светофильтры:
первичный лямбда = 365 нм, вторичный лямбда = 470 нм).
6. Баня водяная с нагревателем.
7. Термометр 0 - 100 °C по ГОСТ 2045-71.
8. Колонка хроматографическая
стеклянная 60 х 30 мм.
9. Колбы конические плоскодонные на 50 мл
с НШ 14,5, на 100 мл с НШ 29 по ГОСТ 23932-79Е.
10. Колбы мерные на 50, 100, 250 мл по
ГОСТ 1770-74Е.
11. Дефлегматорная
насадка по ГОСТ 23932-79Е.
12. Стаканы химические на 500 мл.
13. Цилиндры мерные на 50 мл по ГОСТ
1770-74Е.
14. Воронки химические диаметром 60 мм по
ГОСТ 23932-79Е.
15. Пипетки на 2, 5, 10 мл по ГОСТ
20292-74Е.
16. Бумага фильтровальная по ГОСТ
12026-76.
17. Ионообменная смола Анионит АРА-12п (Cl-форма; фракция 0,25 - 0,10 мм) по ТУ 6-09-10-818-73. Для
перевода смолы в OH-форму 100 г ее помещают в химический стакан, заливают 150
мл 2 н едкого натра, перемешивают и оставляют на 30 мин. Сливают жидкость и
вновь добавляют щелочь. Повторяют процедуру промывания дважды. Тщательно
отмывают смолу дистиллированной водой до pH 7 - 8.
Смолу хранят под водой.
После проведения анализа смолу
регенерируют следующим образом: заливают 1 н соляной кислотой, выдерживают 10 -
15 мин., раствор сливают. Обработку смолы кислотой повторяют дважды. Промывают
дистиллированной водой до нейтральной реакции и переводят смолу в OH-форму, как
описано выше.
18. Фталевый альдегид "ч" по
МРТУ 6-09-5387-68.
19. Соляная кислота "чда" по ГОСТ 3118-77.
20. Ортофосфорная кислота "ч"
по ГОСТ 6552-80.
21. Натр едкий "чда"
по ГОСТ 4328-77.
22. Метиловый спирт "хч" по ГОСТ 6995-77.
23. Гистамин или хлоргидрат
гистамина.
24. Вода
дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
1. Подготовка
образца к анализу
1.1. Отбор образцов
для анализа и хранение их
От правильности осуществления этого этапа
контроля в значительной степени зависят достоверность полученных данных по
содержанию в анализируемом продукте гистамина и объективность гигиенической
оценки его. При исследовании рыб, продуктов из них, пищевых продуктов из
морских животных эта задача является весьма важной и требует соответствующей
предварительной подготовки. Как известно, отбор проб пищевых продуктов
слагается из нескольких этапов: отбора транспортных упаковок, отбора пробы и
навесок для анализа.
Каждая из перечисленных операций должна
производиться в строгом соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые
продукты: ГОСТ 7631-73 "Рыба, продукты из рыбы, морских млекопитающих и
беспозвоночных" (с. 12 - 17) и ГОСТ 8756-70 "Продукты пищевые
консервированные" (с. 1 - 5).
Отобранные в соответствии с указанным образцы рыбы, продуктов из рыб, морских
млекопитающих и беспозвоночных, подлежащих исследованию, упаковывают каждый в
отдельности в пергаментную бумагу или в целлофан, затем в плотную оберточную бумагу
и перевязывают бечевкой, для этой цели можно использовать также чистые
стеклянные банки с притертыми стеклянными или плотными корковыми пробками.
Образцы доставляют в лабораторию сразу же после отбора, в случае длительной
транспортировки их охлаждают до температуры +2 - 4 °C, используя для этой цели
холодильники или соответствующие приспособления.
К исследованию образцов следует
приступить в день доставки их в лабораторию. При отсутствии такой возможности
образцы должны храниться при температуре, предусмотренной для хранения данной
продукции, не более 3 сут. со времени отбора среднего
образца.
1.2. Подготовка
образца к исследованию
Рыбу, отобранную для исследования,
размораживают, очищают от механических загрязнений и чешуи. Обмывание рыбы не
допускается.
Для исследования крупной рыбы берут
только мясо без кожи и костей. Для этого от рыбы отделяют голову и плавники,
разрезают тушку по брюшку и удаляют все внутренности; разрезают продольным
разрезом по спинке и удаляют позвоночник и, по возможности, все ребра, а мясо
вместе с подкожным жиром тщательно соскабливают с кожи. Мелкую рыбу исследуют
целиком.
При весе каждого неразделанного
экземпляра рыбы свыше 500 г после разделки берут для дальнейшего измельчения
только одну продольную половину рыбы.
При весе одной продольной половины рыбы
свыше 1 кг ее разрезают на поперечные куски шириной 2 - 4 см и берут для
анализа мясо от половины всего числа кусков через один.
Мелкую неразделанную рыбу или пробу мяса
от крупной рыбы дважды пропускают, как можно быстрее, через мясорубку; фарш
тщательно перемешивают и из разных мест отбирают навеску в соответствии с
прописью избранного метода.
При исследовании консервов из рыб или
морских животных из содержимого всех банок, выделенных в качестве среднего
образца, после определения соотношения составных частей (жидкой и твердой)
готовят одну общую пробу. Специи (лук, перец и др.) должны быть удалены из
рыбы. Твердую часть консервов быстро пропускают два раза через мясорубку,
смешивают с жидкой частью и растирают по частям в фарфоровой ступке до
состояния однородной массы. Консервы, имеющие заливку, рассол, можно измельчать
на аппарате "Измельчитель тканей". Из
подготовленной таким образом пробы отбирают навески для последующих
определений.
Средние образцы продукции сохраняются в
холодильнике до конца анализа; в случае обнаружения гистамина в количестве выше
установленной гигиенической нормы - до вручения результатов исследований в
соответствующие учреждения и принятия необходимых профилактических мер.
2. Экстракция
Навеску 10 г (с
точностью 0,01 г) приготовленного образца помещают в сосуд микроразмельчителя
тканей, добавляют 25 мл метанола и перемешивают 5 мин. Полученную смесь
переносят в плоскодонную коническую колбу на 100 мл, ополаскивают сосуд
смесителя 15 - 20 мл метанола, сливают в колбу, снабженную дефлегматором, и
нагревают на водяной бане до 60 °C 15 мин.; затем охлаждают до комнатной
температуры и фильтруют через
складчатый бумажный фильтр в мерную колбу на 50 мл. Осадок промывают метанолом
и доводят до метки объем экстракта. Метанольный
экстракт можно хранить в холодильнике несколько недель.
3. Очистка
экстракта
В стеклянную хроматографическую
колонку (60 х 30 мм) заливают суспензию ионообменной смолы Анионит АРА-12п до
образования столбика высотой 40 мм и промывают 20 мл дистиллированной воды.
(Вода должна покрывать смолу постоянно).
Наносят 5 мл метанольного
экстракта, добавляют 5 мл 1 н соляной кислоты, пропускают через колонку и элюируют дистиллированной водой до получения 35 мл элюата. Элюат следует хранить в
холодильнике.
4. Построение
калибровочной кривой
Для приготовления
основного раствора, содержащего 10 мкг/мл гистамина, 2,5 мг гистамина
растворяют в 0,1 н соляной кислоте в мерной колбе на 250 мл. 1, 2 и 3 мл
основного раствора помещают в мерные колбы на 100 мл, доводят 0,1 н соляной
кислотой до метки и получают рабочие растворы с концентрациями 0,1 мкг/мл, 0,2
мкг/мл и 0,3 мкг/мл соответственно.
Основной раствор гистамина хранят в
холодильнике неделю, рабочие растворы готовятся ежедневно.
10 мл
каждого рабочего раствора
вносят в колбы на 50 мл, добавляют
10 мл 0,1 н
соляной кислоты, 3 мм 1 н
едкого натра и смешивают.
При
перемешивании вносят 1 мл 0,1% метанольного
раствора о-фталевого альдегида,
через 4
мин. добавляют 3 мл 3,47 н фосфорной
кислоты и оставляют на 1,5 ч
при комнатной
температуре. Измеряют интенсивность флуоресценции рабочих
стандартных растворов
гистамина при лямбда =
365 нм,
возбуждения
лямбда = 465
нм.
На основании полученных
данных строится
эмиссии
калибровочная кривая
зависимости интенсивности флуоресценции от
концентрации
гистамина в растворе. Каждое деление оси абсцисс соответствует
0,02 мкг гистамина
в 1 мл раствора.
5. Количественное
определение гистамина в рыбопродуктах
10 мл элюата
вносят в колбу на 50 мл, добавляют 10 мл 0,1 н соляной кислоты и перемешивают.
Далее проводят процедуру, описанную в п. 4 "Построение калибровочной
кривой".
Если образцы содержат гистамина более 100
мг/кг рыбы, необходимо взять 1 мл элюата, добавить 10
мл 0,1 н соляной кислоты и далее повторить процедуру количественного
определения гистамина.
Для количественного определения
содержания гистамина используется калибровочная кривая.
Содержание гистамина в рыбе Г (в мг/кг)
вычисляется по формуле:
С х А х В х Ф
о
Г = --------------,
Б х Р
где:
С
- концентрация гистамина
в растворе образца,
найденная по
о
калибровочной
кривой, мкг/мл;
Р - навеска
образца для анализа в г (10 г);
А - объем метанольного
экстракта в мл (50 мл);
Б - количество метанольного экстракта,
пропущенного через колонку в мл
(5 мл);
В - объем элюата
в мл (35 мл);
мл элюата + мл 0,1 н HCl
Ф - фактор разведения:
------------------------.
мл элюата