МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

 

ПРИКАЗ

от 2 апреля 1986 г. N 450

 

О МЕРАХ ПО ПРЕДУПРЕЖДЕНИЮ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ДИФТЕРИЕЙ

 

В целях улучшения организации и проведения мероприятий по предупреждению заболеваемости дифтерией

Приказываю:

1. Министрам здравоохранения союзных республик:

1.1. Во изменение Приказа N 50 от 14.01.80 Министерства здравоохранения СССР "О календаре профилактических прививок и основных положениях об их организации и проведении" ревакцинацию против дифтерии проводить в сроки: через 1,5 - 2 года после законченной вакцинации, в 9, 16 лет и через каждые 10 лет взрослому населению.

1.2. Обеспечить все лечебно-профилактические и санитарно-эпидемиологические учреждения неснижаемым запасом противодифтерийной сыворотки в соответствии с Приказом Минздрава СССР N 711 от 8 декабря 1965 г. "Об утверждении неснижаемого минимума наличия сыворотки, вакцин, гамма-глобулинов и противомалярийных препаратов в лечебно-профилактических учреждениях, аптеках и санитарно-эпидемиологических станциях".

1.3. Ввести обязательную однократную бактериологическую диагностику больных ангинами (лакунарной, фолликулярной, флегмонозной и язвенно-некротической). На территориях с повышенным уровнем заболеваемости кратность бактериологического обследования может быть увеличена.

1.4. Обеспечить своевременную диагностику и обязательную госпитализацию больных или подозрительных на дифтерию лиц, адекватную и специфическую терапию (в соответствии с Методическими рекомендациями Минздрава СССР "Клиника, диагностика и лечение дифтерии" N 511-14/3-6 от 04.06.1981).

1.5. Провести семинары для эпидемиологов, инфекционистов, терапевтов, педиатров, отоларингологов, врачей-бактериологов, а также среднего медперсонала по вопросам эпидемиологии, диагностики, клиники, лечения и профилактики дифтерии.

1.6. Проверить организацию иммунопрофилактики дифтерии, в первую очередь, на тех предприятиях, где в 1983 - 1985 гг. регистрировались больные дифтерией среди детей. Провести необходимую коррекцию планов профилактических прививок против дифтерии.

Шире использовать серологические методы для иммунологических обследований (диагностических - в динамике для дифференциальной диагностики дифтерии; эпидемических - для выявления незащищенных в очагах дифтерии; выборочных профилактических - для оценки привитости и иммунности).

1.7. Проверить работу бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологических станций и лечебно-профилактических учреждений, в первую очередь, в тех территориях, где в последние годы не отмечалась высеваемость даже нетоксигенных коринебактерий дифтерии (отсутствие высеваемости свидетельствует о некачественной работе бактериологических лабораторий).

Утверждаю:

Инструкции по проведению эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией (Приложение 1); по организации, планированию и учету прививок (Приложение 2); по проведению профилактических прививок против коклюша, дифтерии и столбняка (Приложение 3); по проведению противоэпидемических мероприятий в очаге дифтерийной инфекции (Приложение 4); по бактериологической и серологической индикации возбудителей дифтерии и его токсина (Приложение 5).

Приказ Министерства здравоохранения СССР N 580 от 26 июня 1974 г. "О состоянии заболеваемости дифтерией в СССР и мерах по ее дальнейшему снижению" считать утратившим силу.

Контроль за выполнением настоящего Приказа возложить на заместителей Министра здравоохранения СССР тов. Щепина О.П., Бургасова П.Н., Сафонова А.Г.

Министерствам здравоохранения союзных республик, министерствам и ведомствам СССР, имеющим медицинскую службу, разрешается размножить настоящий Приказ и утвержденные инструкции в необходимом количестве экземпляров.

 

Министр

С.П.БУРЕНКОВ

 

 

 

 

 

Приложение 1

к Приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 2 апреля 1986 г. N 450

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ПРОВЕДЕНИЮ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

ЗА ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

 

Эпиднадзор за дифтерийной инфекцией представляет собой наблюдение за эпидемическим процессом, включая заболеваемость дифтерией и факторы, способствующие ее распространению (иммунологическая незащищенность населения, распространение возбудителя, патология ЛОР-органов).

Целью эпиднадзора является оценка эпидситуации и разработка эпидемиологически обоснованных мероприятий, направленных на предупреждение формирования групповых заболеваний и летальных исходов дифтерии.

Система эпидемиологического надзора включает:

1. Наблюдение за иммунологической структурой населения.

2. Слежение за циркуляцией возбудителя среди населения.

3. Раннее выявление больных дифтерией.

4. Эпидемиологический анализ и оценка эффективности проведенных мероприятий. Прогнозирование эпидпроцесса дифтерийной инфекции на конкретной территории.

Результаты анализа полученных данных должны быть использованы как основа для планирования и оперативного проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Эпидемиологический надзор осуществляется по областям (краям). Общее руководство организацией и осуществлением эпиднадзора в области (крае) возлагается на заведующих областными (краевыми) отделами здравоохранения. Главный педиатр, главный терапевт, главный инфекционист области (края) возглавляют работу по раннему выявлению, диагностике дифтерии и лечению больных. Главный педиатр, главный терапевт совместно с главным врачом областной (краевой) санэпидстанции осуществляют руководство иммунологическим обследованием населения. Главный врач областной (краевой) санэпидстанции обеспечивает проведение необходимых бактериологических обследований населения. Разработку плана мероприятий по реализации программы эпиднадзора в области (крае) осуществляет эпидемиолог области (краевой) санэпидстанции, который определяет контингенты для иммунологического и бактериологического обследования, обобщает и анализирует результаты эпиднадзора, разрабатывает рекомендации. Перечисленные областные (краевые) специалисты организуют и контролируют осуществление эпиднадзора в районах и в автономных республиках.

Общее руководство эпиднадзором в республике осуществляется министром здравоохранения республики. Контроль и методическое руководство за проведением эпиднадзора в республике осуществляется республиканской санэпидстанцией.

Программа эпиднадзора осуществляется комплексно эпидемиологами, педиатрами, терапевтами, инфекционистами, отоларингологами, иммунологами и бактериологами, организаторами здравоохранения.

 

1. Наблюдение за иммунологической структурой населения

 

Для своевременной коррекции иммунитета населения необходима регулярная оценка защищенности различных групп населения. Оценка иммунитета проводится путем сопоставления материалов прививочной документации и результатов определения дифтерийного антитоксина.

1.1. Наблюдение за привитостью населения на территории амбулаторно-поликлинического учреждения

Для анализа состояния привитости детского населения каждой возрастной группы отбирают не менее 100 историй развития детей (форма 112/у) и карт учета профилактических прививок (форма 063/у) или медицинских карт ребенка (026/у).

Для характеристики привитости ребенка следует руководствоваться терминами "привит по схеме" или "привит вне схемы" (в недекрерованном возрасте, пропуск одной из возрастных ревакцинаций, нарушение первичного вакцинального комплекса и т.п.). Определяют общий процент охвата детей прививками каждого возраста, включая данные о детях с законченным курсом вакцинации и ревакцинаций, а также находящихся в стадии вакцинации.

Процент охвата иммунопрофилактикой детей, подлежащих прививкам, должен составлять не менее 97 - 98%. Дети в возрасте до 12 месяцев должны получить три прививки вакциной АКДС или две прививки АДС-М-анатоксином не менее чем в 75%. Дети в возрасте 2-х лет должны получить первичную ревакцинацию не менее чем в 75%.

Педиатр и эпидемиолог обязаны своевременно выяснить причины, из-за которых ребенок не был привит, и незамедлительно принять необходимые меры.

В возрастной группе 15 - 17 лет оценку состояния привитости проводят по данным форм: 025-1/у - вкладной лист на подростка к медицинской карте амбулаторного больного, 025-3/у - медицинская карта студента ВУЗа, учащегося среднего специального заведения и 064/у - журнал учета профилактических прививок.

Процент охвата возрастными ревакцинациями в декретированные сроки (9 и 16 лет) должен достигать 97 - 98%.

Анализ привитости групп повышенного риска заболевания дифтерией взрослого населения, подлежащих ревакцинации, проводят по данным журналов учета профилактических прививок.

1.2. Иммунологический контроль

Состояние иммунитета против дифтерии у детей и подростков проверяют с помощью РПГА с дифтерийным диагностикумом.

Для оценки фактической привитости детей и подростков ассоциированными вакцинами со столбнячным компонентом сыворотки крови необходимо параллельно испытывать с дифтерийным и столбнячным антигенными диагностикумами.

Плановый иммунологический контроль осуществляют выборочно в городах и сельских районах каждой области, края или района (для республик с районным административным делением). Формирование выборки определяет эпидемиолог (области, края, республики с районным административным делением).

Обследованием должны быть охвачены все районы области, края, республики с районным делением в течение 5 - 6 лет.

В каждой области, крае, республике с районным административным делением ежегодно обследуют не менее 4-х районов, различающихся по эпидемическим показателям (наличие или отсутствие заболеваний дифтерией и очагов носительства токсигенных коринебактерий дифтерии).

Примечание. Указанные коммерческие диагностикумы выпускают Ленинградский ПЭМ им. Пастера и Московский НИИВС им. Мечникова.

 

В каждом районе обследованию подлежат дети и подростки в возрасте от 3-х до 17 лет по 60 человек каждого возраста, в том числе 50% должны составлять проживающие в сельской местности. Всего в районе в течение года должно быть обследовано не менее 900 детей и подростков.

Определение уровня и напряженности иммунитета в организованных коллективах необходимо проводить не менее чем в 2 - 3-х учреждениях одного типа при обследовании каждой возрастной группы.

Выявление в каждой возрастной группе до 10% серонегативных лиц может служить условным показателем защищенности детей и подростков и хорошо поставленной прививочной работы в районе.

В случае повышения этого показателя в той или иной возрастной группе свыше 10% необходимо провести серологическое обследование всех лиц этого возраста в районе.

Выявленные серонегативные лица подлежат реиммунизации. Выбор препарата определяется состоянием у них противостолбнячного иммунитета. В случае обнаружения в этих сыворотках антител к столбнячному анатоксину в титре, превышающем защитный, ревакцинацию проводить АДМ-анатоксином.

При выявлении серонегативных к дифтерийному и столбнячному анатоксинам детей и подростков прививки проводить АДС-М-анатоксином с последующим серологическим контролем в РПГА с обоими диагностикумами.

Высокий процент привитых против дифтерии и столбняка в учетных документах в сочетании с высоким процентом серонегативных лиц к столбнячному анатоксину может свидетельствовать о недостоверности записей о прививках. Каждый подобный случай требует специального квалифицированного расследования.

Высокий процент защищенности от дифтерии (по результатам РПГА) в сочетании с высоким процентом серонегативных лиц к столбнячному анатоксину является отражением напряженного эпидпроцесса дифтерии. Отсутствие при этом регистрируемой заболеваемости дифтерией может быть обусловлено некачественной работой по активному выявлению больных, особенно с легкими формами заболевания (недостаточный объем бактериологических обследований больных с диагнозом ангина: нарушение правил взятия и доставки материала для бактериологического исследования; некачественная работа бактериологической лаборатории - отсутствие высеваемости даже нетоксигенных коринебактерий и др.).

 

2. Слежение за циркуляцией возбудителя дифтерии

 

Для выявления источников инфекции и наблюдения за распространенностью токсигенных коринебактерий дифтерии необходимо проводить бактериологическое обследование:

1. С диагностической целью: больных детей и взрослых с острыми воспалительными явлениями в носоглотке при подозрении на дифтерийную этиологию заболевания (ринит, ларинготрахеит, ларингит, круп) ежегодно в течение трех дней с момента обращения; больных ангинами с патологическим выпотом на миндалинах, с подозрением на паратонзиллит, заглоточный (паратонзиллярный) абсцесс, инфекционный мононуклеоз, стенозирующий ларинготрахеит - однократно.

2. По эпидемическим показаниям: детей и взрослых, бывших в общении с источником инфекции (однократно); при осложнении эпидемической ситуации на данной территории проводят бактериологическое обследование контингентов повышенного риска заболевания - по заключению эпидемиолога - однократно.

3. С профилактической целью: лиц, вновь поступающих в детские дома, школы-интернаты, специальные учреждения для детей с поражением центральной нервной системы, санатории для детей с туберкулезной интоксикацией, детские и взрослые психоневрологические стационары (однократно).

 

3. Раннее выявление заболеваний дифтерией

 

В целях раннего выявления дифтерии осуществляется активное наблюдение за больными ангиной с патологическими наложениями на миндалинах (включая паратонзиллярные абсцессы) в течение не менее 3-х дней от первичного обращения; проводится однократное бактериологическое обследование на дифтерию. Материал для исследования берут при первом обращении больного врач или медсестра дома или в поликлинике (до начала лечения антибиотиками или др. антибактериальными препаратами). В крайнем случае - на следующий день при активном посещении больного. Доставка материала в лабораторию осуществляется в течение 2 - 3 часов с момента его взятия.

При наблюдении за больными ангиной должна соблюдаться четкая преемственность на всех этапах - от момента обращения до госпитализации (фельдшерско-акушерский пункт, ФАП), скорая и неотложная помощь, поликлиника, стационар). Медицинские работники скорой и неотложной помощи, врачи-отоларингологи и цеховые врачи обязаны передавать активные вызовы участковым педиатрам и терапевтам. В направлениях на госпитализацию необходимо указывать первоначальные симптомы заболевания, лечение, сведения о профилактических прививках и о контактах с больными дифтерией или бактерионосителями. Аналогичные сведения необходимо указывать на направлении на госпитализацию больных дифтерией или с подозрением на нее, а также бактерионосителей токсигенных коринебактерий дифтерии.

Особое внимание требуют к себе непривитые дети. Они нуждаются в активном наблюдении при возникновении у них любого острого заболевания верхних дыхательных путей. В случае заболевания ангиной с наложениями или стенозирующим ларинготрахеитом (крупом) следует принять меры к их ранней госпитализации и обеспечить им в стационаре консультативную помощь квалифицированного врача-инфекциониста или педиатра.

Немедленной госпитализации в боксы или отдельные палаты инфекционных больниц подлежат больные дифтерией, с клиническим подозрением на дифтерию, с диагнозом ангина и круп из очага дифтерийной инфекции; бактерионосители токсигенных коринебактерий дифтерии.

Госпитализации в провизорное отделение подлежат больные тяжелыми ангинами, больные ангиной из закрытых детских учреждений и общежитий, из неблагоприятных бытовых условий, лица, принадлежащие к контингентам "риска заболевания дифтерией". Объем госпитализации больных ангиной может быть увеличен в соответствии с эпидемической ситуацией.

Должна быть обеспечена госпитализация всех направляемых в стационар больных ангиной. При организации провизорной госпитализации больных ангиной должен быть предусмотрен круглосуточный забор материала для бактериологического исследования на дифтерию, обеспечены консультативная и лечебная помощь кардиолога, невропатолога, оказание экстренных мероприятий (интубация, трахеостомия), бесперебойное снабжение противодифтерийной сывороткой.

Ранняя диагностика токсической или распространенной формы дифтерии, а также дифтерийного крупа основывается только на клинической симптоматике, поэтому очень важно при подозрении на дифтерию определить форму и степень тяжести заболевания. Если имеется подозрение на токсическую форму дифтерии, лечение противодифтерийной сывороткой нужно начинать немедленно в соответствии со степенью тяжести заболевания. Противодифтерийная сыворотка вводится больному в стационаре. При невозможности быстрой транспортировки больного тяжелой формой дифтерии в стационар, в исключительных случаях, введение противодифтерийной сыворотки начинают на фельдшерско-акушерском пункте или на дому со строгим соблюдением всех необходимых правил. Бактериологическое обследование с клиническим подозрением на дифтерию в стационаре проводят в день поступления и затем в течение 2-х дней подряд, на протяжении которых нецелесообразно назначать антибиотики из группы тетрациклинов, эритромицин и левомицетин. При наличии клинических показаний к антибактериальной терапии предпочтительно начинать ее антибиотиками из группы пенициллинов.

При типичной клинической картине дифтерии отсутствие бактериологического подтверждения не является основанием для отмены диагноза. При этом следует учитывать эффект сывороточной терапии (если она применялась). При сомнительной клинической картине первоначальный диагноз - дифтерия (или подозрение на это заболевание) может быть отменен при получении трехкратных отрицательных результатов бактериологического исследования и отсутствии характерных для дифтерии осложнений.

Диагноз ангина с сопутствующим носительством токсигенных коринебактерий на практике устанавливаться не должен. Высев токсигенных коринебактерий дифтерии у больного ангиной с патологическими наложениями является основанием для установления у него диагноза дифтерия.

Высев нетоксигенных коринебактерий дифтерии при типичной клинической картине заболевания не является основанием для отмены диагноза и расценивается как сопутствующее носительство; при сомнительной клинической картине - подтверждает возможность отмены диагноза. Возникновение характерных для дифтерии осложнений (миокардит, токсический нефроз, парез мягкого неба, полирадикулоневрит) у больных, перенесших ангину, является основанием для ретроспективной дифференциальной диагностики дифтерии.

Для предотвращения формирования групповых очагов дифтерийной инфекции (очагов заболеваний, очагов бактерионосительства), для раннего выявления больных дифтерией необходимо ежегодно проводить плановый (однократный) отоларингологический осмотр детей и подростков в организованных коллективах в момент их формирования (сентябрь-октябрь) с незамедлительным началом лечения лиц с ЛОР-патологией. При выявлении в группе (классе) большого числа с ЛОР-патологией - по заключению отоларинголога и эпидемиолога - при необходимости может быть проведено бактериологическое обследование лиц этой группы (класса).

 

4. Эпидемиологический анализ и оценка эффективности

проведенных мероприятий по эпидкартам

 

Эпидемиологический анализ должен включать оценку:

а) состояния заболеваемости в целом по территории и по отдельным районам, по возрастам, профессиональным группам, сезонности и очаговости; клинические формы дифтерии и тяжесть заболевания. Особое внимание должно быть уделено анализу причин летальных исходов;

б) распространенности носительства токсигенных коринебактерий дифтерии, характеристику очаговости, по возрастным и профессиональным группам, по биовару возбудителя дифтерии и по показаниям к бактериологическому обследованию;

в) состояния привитости детского населения по документальным данным и результатам иммунологических исследований (оценка степени их соответствия).

Эпидемиологический анализ должен проводиться раздельно - по городам и сельской местности.

Неблагоприятными прогностическими признаками являются:

1. Регистрация очагов групповых заболеваний дифтерией (2-х и более случаев дифтерии в очаге), наличие летальных исходов, регистрация тяжелых форм дифтерии у правильно привитых (по документам) лиц.

2. Рост высеваемости токсигенных коринебактерий дифтерии более чем в 2 - 3 раза по сравнению с предыдущим годом, наличие "вспышек" носительства.

3. Низкий уровень противодифтерийного иммунитета (уровень дифтерийного антитоксина у детей ниже защитного титра более чем у 10% от числа обследованных лиц прививаемых контингентов; у взрослых - свыше 50%).

4. Отсутствие регистрируемой заболеваемости дифтерией - при наличии следующих фактов:

а) сочетание большого процента детей и подростков, охваченных противодифтерийными прививками (по данным прививочной документации) с высоким процентом лиц, имеющим титры столбнячного антитоксина ниже защитного уровня;

б) сочетание большого процента детей и подростков, не защищенных от столбняка с высокими титрами дифтерийного антитоксина, свидетельствует о напряженном эпидпроцессе;

в) недостаточный объем бактериологических обследований больных ангинами;

г) длительное (более 3 - 6 месяцев) отсутствие в бактериологической лаборатории высеваемости даже нетоксигенных коринебактерий дифтерии.

 

5. Рекомендации по планированию мероприятий на территории,

признанной эпидемически неблагополучной

 

При неблагополучной эпидемической ситуации необходимо обеспечить:

а) максимальный охват детей прививками против дифтерии в установленные сроки АКДС-вакциной, АДС-М-анатоксином и взрослых контингентов повышенного риска заболевания: лиц, проживающих в общежитиях, работников сферы обслуживания, студентов и сотрудников специальных средних и высших учебных заведений, учителей и обслуживающий персонал школ, работников детских и медицинских учреждений. Контингенты взрослых, подлежащих прививкам против дифтерии, могут быть расширены по заключению эпидемиологов на местах в соответствии с эпидемической ситуацией;

б) проведение бактериологического обследования контингентов повышенного риска инфицирования: детских домов, домов ребенка, учащихся школ-интернатов; студентов высших и средних учебных заведений и взрослых, проживающих в общежитиях, преподавателей школ и ГПТУ; работников сферы обслуживания населения, детских дошкольных и медицинских учреждений, а также персонал и больных туберкулезных и психоневрологических больниц детских и взрослых (учреждений с низкой иммунной прослойкой) по заключению эпидемиолога - однократно;

в) повышение внимания врачей к ранней диагностике дифтерии. Разбор каждого случая дифтерии, оценку качества диагностики и лечения необходимо осуществлять в сопоставлении с очаговостью и своевременностью проведения противоэпидемических мероприятий - с участием эпидемиолога, инфекциониста, терапевта, педиатра, бактериолога.

Критериями эффективности профилактических и противоэпидемических мероприятий являются предотвращение формирования очагов групповых заболеваний дифтерией и летальных исходов. Необходимо подчеркнуть, что на первом этапе осуществления эпиднадзора результатом качественно проведенных мероприятий может быть увеличение регистрируемой заболеваемости дифтерией, сопровождающееся, однако, ростом удельного веса легких форм заболевания.

Полноценное осуществление эпиднадзора в течение ряда лет обеспечит резкое снижение заболеваемости дифтерией, стабилизацию ее на низком уровне.

 

Заместитель начальника Главного

управления карантинных инфекций

Минздрава СССР

М.И.НАРКЕВИЧ

 

 

 

 

 

Приложение 2

к Приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 2 апреля 1986 г. N 450

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ОРГАНИЗАЦИИ, ПЛАНИРОВАНИЮ И УЧЕТУ ПРИВИВОК

 

Эпидемиологическая эффективность иммунизации зависит от полного и своевременного охвата прививками против дифтерии детского населения. С этой целью два раза в год (весной и осенью) проводится перепись всех детей в возрасте до 14 лет включительно. Перепись на участке осуществляют медицинские сестры или фельдшера при подворных обходах.

Учет детей в детских дошкольных учреждениях, школах и школах-интернатах, расположенных на территории обслуживания лечебно-профилактического учреждения, проводят однократно осенью (сентябрь).

В период между переписями в журнал медицинского участка вносят сведения о вновь прибывших детях и снимают с учета выбывших (временный отъезд на срок не более одного года не является поводом для снятия с учета). Эти данные уточняют при посещении медицинскими работниками новорожденного или вновь прибывшего ребенка, при патронажных обходах и при обслуживании больных детей на дому.

По окончании переписи списки детей сверяют с картами профилактических прививок (форма 063/у) или с журналами учета профилактических прививок (форма 064/у), с историями развития ребенка (форма 112/у) и медицинскими картами ребенка (форма 026/у), уточняют расхождения и на вновь выявленных детей заполняют соответствующую документацию.

Сведения о проведенных профилактических прививках в детских дошкольных учреждениях и школах передаются ежемесячно в письменном виде медицинским работником этого учреждения заведующему дошкольно-школьным отделением или заместителю главного врача детской поликлиники (отделения) и вносятся в карту профилактических прививок (форма 063/у) и историю развития ребенка (форма 112/у).

 

Планирование прививок

 

Годовой план профилактических прививок составляют на основании полного учета детских контингентов и проведенных ранее прививок. В план включают прививки детям, посещающим и не посещающим детские учреждения, а также учащимся школ, школ-интернатов, расположенных на территории обслуживания данного лечебно-профилактического учреждения.

В детских поликлиниках поименный список детей, подлежащих прививкам, составляет участковый врач совместно с медицинской сестрой-картотетчицей на основании указанных выше форм (112/у, 063/у). В дошкольных учреждениях и школах план составляют врач этого учреждения и медицинская сестра на основании формы 026/у. Сводный план лечебно-профилактического учреждения передают в СЭС.

В сельской местности при работе по принципу централизованных картотек план прививок составляет сестра-картотетчица при участии врача участковой больницы или фельдшера фельдшерско-акушерского пункта. При отсутствии централизованной прививочной картотеки планирование проводит медицинский персонал сельских врачебных амбулаторий фельдшерско-акушерских пунктов под контролем врача-педиатра. Планы представляют в участковую или центральную районную больницу, где составляют план по району и передают в СЭС.

При проверке планов прививок эпидемиолог использует данные о рождаемости, численном составе детского населения и отчеты о прививках, проведенных в предыдущем году. В конце года санэпидстанции в план прививок вносят коррективы, предварительно согласованные с руководителями лечебно-профилактических учреждений.

При составлении плана вакцинации следует исходить из данных о количестве детей, родившихся в четвертом квартале предыдущего года, и ориентировочном числе новорожденных за девять месяцев планируемого года:

а) число детей, родившихся в четвертом квартале предыдущего года, устанавливают на основании сведений, получаемых лечебно-профилактическими учреждениями из родильных домов, а также из ЗАГСов;

б) сведения о числе родов, предстоящих в течение девяти месяцев планируемого года, определяют средними данными о числе родившихся за аналогичный период в предшествующие три года. Кроме того, в план вакцинации включают число непривитых детей в возрасте до 14 лет, не имеющих постоянных противопоказаний к проведению прививок.

Вакцинация проводится с 3-месячного возраста трехкратно.

Первой ревакцинации подлежат:

а) дети с законченным курсом вакцинации, у которых с момента последней прививки АКДС-вакциной прошло 1,5 года и более, после прививки АДС-М-анатоксином - 6 - 9 мес. и более;

б) дети, у которых после второй вакцинации АКДС-вакциной прошло 12 мес. и более.

Второй ревакцинации подлежат:

а) дети 9 лет, получившие первую ревакцинацию;

б) дети, прививаемые вне схемы иммунизации, у которых с момента первой ревакцинации АКДС-вакциной прошло 9 - 10 лет, а АДС-М- и АДС-анатоксинами - 6 - 7 лет.

Третьей ревакцинации подлежат:

подростки 16 лет, получившие вторую ревакцинацию в 9 лет или по старой схеме в 6 - 8 лет.

Последующие ревакцинации планируют с интервалом 10 лет.

Постоянные и длительные временные медицинские противопоказания определяет комиссия с участием заведующего отделением поликлиники, соответствующего специалиста и участкового врача с обязательным оформлением в ф. 112/у заключения и плана оздоровительных мероприятий.

В случае необходимости комиссия направляет ребенка на консультацию к соответствующим специалистам лечебно-профилактических учреждений. Диагнозы и рекомендации специалистов учитываются комиссией при решении вопроса об оформлении медицинских противопоказаний. Временные длительные медицинские противопоказания подлежат пересмотру по истечении установленного срока.

Кратковременные медицинские противопоказания оформляют участковые педиатры в соответствии с наставлением к препаратам, утвержденным МЗ СССР.

Взрослому населению план прививок против дифтерии составляют медицинские работники в лечебно-профилактических учреждениях по месту жительства или работы: в городских и районных поликлиниках - врачи кабинетов инфекционных заболеваний; в медсанчастях крупных промышленных предприятий - их медицинские работники; на фельдшерско-акушерских пунктах - заведующие этих пунктов под руководством участкового терапевта. План прививок направляют в СЭС для согласования. За организацию правильного планирования прививок взрослому населению и их проведение отвечают главные врачи городских ЦРБ и сельских участковых больниц.

 

Порядок ведения картотеки и учета привитости детей

 

Учетно-оперативными документами для регистрации профилактических прививок и иммунологических проб являются карты профилактических прививок (форма 063/у) и форма 064/у в сельских районах, не переведенных на централизованные формы прививок. Они заполняются на всех детей в возрасте до 14 лет включительно, проживающих в районах обслуживания лечебно-профилактического учреждения, в том числе и на детей, посещающих детские учреждения и школы, независимо от места нахождения этих учреждений. Карты учета профилактических прививок (форма 063/у) раскладывают по отдельным врачебным участкам. На каждом участке формы 063/у размещают по срокам и видам прививок по месяцам года на всех детей, в том числе и на посещающих детские учреждения, находящиеся на территории обслуживания других поликлиник. На детей, проживающих на участке и посещающих детские учреждения на территории обслуживания данного лечебно-профилактического учреждения, карты формы 063/у раскладываются по детским учреждениям (школы, школы-интернаты, детские сады, детские ясли) отдельно.

Проведенные противодифтерийные прививки медицинский работник прививочного кабинета записывает в историю развития ребенка (форма 112/у). В карту (форма 063/у) эти данные вносит лицо, ответственное за картотеку.

Контроль за правильностью ведения картотеки и полнотой охвата детей прививками возлагается в городе на заведующего отделением поликлиники, в сельской местности - на районного педиатра, которые обязаны систематически проверять:

1. Полноту учета детей.

2. Своевременность проведения прививок.

3. Обоснованность временных и постоянных медицинских противопоказаний к проведению прививок.

4. Получение сведений о сделанных прививках детям, проживающим на территории данной поликлиники, но посещающим детские учреждения, находящиеся под наблюдением других поликлиник.

5. Запись участкового врача об осмотре ребенка и термометрии перед прививкой.

6. Регистрацию прививок в учетных картах и историях развития с указанием даты прививки, названия препарата, его дозы и серии.

7. Достоверность данных учета и отчетности о проведенных прививках.

 

Начальник Главного управления

лечебно-профилактической помощи

Минздрава СССР

А.М.МОСКВИЧЕВ

 

Заместитель начальника Главного

управления лечебно-профилактической

помощи детям и матерям Минздрава СССР

В.Б.КУЗНЕЦОВА

 

Начальник Управления медицинской

статистики и вычислительной техники

Минздрава СССР

Г.Ф.ЦЕРКОВНЫЙ

 

 

 

 

 

Приложение 3

к Приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 2 апреля 1986 г. N 450

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ПРОВЕДЕНИЮ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРИВИВОК

ПРОТИВ КОКЛЮША, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКА

 

Полноценная профилактика коклюша, дифтерии и столбняка может быть достигнута только при условии своевременной и качественной иммунизации детей, проводимой в соответствии с инструкцией.

Для иммунизации применяются следующие препараты:

 

1. Характеристика препаратов

 

Адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС) представляет собой гомогенную взвесь, состоящую из коклюшных микробов 1 фазы, убитых мертиолятом натрия, очищенных и концентрированных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия. В 1 миллилитре вакцины содержится 20 млрд. коклюшных микробных клеток, 30Lf дифтерийного и 10 единиц связывания столбнячного анатоксина. Консервант - мертиолят натрия в концентрации 0,01%.

Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин (АДС) состоит из смеси концентрированных и очищенных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия. Препарат содержит в 1 мл 60 флокулирующих единиц дифтерийного и 20 единиц связывания столбнячного анатоксина. Консервант - мертиолят в концентрации 0,01%.

Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М) представляет смесь концентрированных и очищенных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия. В 1 мл вакцины содержится 10Lf дифтерийного и 10 ЕС столбнячного анатоксинов.

Адсорбированный дифтерийный анатоксин с уменьшенным содержанием дифтерийного антигена (АД-М) - очищенный, концентрированный адсорбированный на гидроокиси алюминия препаратов. В 1 мл вакцины содержится 10Lf дифтерийного анатоксина.

После замораживания вакцины и анатоксины к применению непригодны.

 

2. Применение и дозировка

 

1. Адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной (АКДС) вакциной прививают детей в возрасте с 3-х месяцев, не имеющих противопоказаний к введению этой вакцины.

Прививки АКДС-вакциной проводят по следующей схеме:

а) курс вакцинации АКДС-вакциной состоит из трех внутримышечных инъекций препарата в дозе 0,5 мл каждая с интервалом 45 дней между вакцинациями. Сокращение этих интервалов не допускается. При необходимости удлинения интервалов между первой или второй вакцинациями свыше указанных сроков очередную вакцинацию (особенно вторую вакцинацию) следует проводить в ближайший возможный срок, определяемый состоянием здоровья ребенка. В исключительных случаях, если после первой прививки прошло даже более года, курс вакцинации не должен превышать трех инъекций. Прививки АКДС-вакциной проводят одновременно с вакцинацией против полиомиелита.

Примечание: При развитии у ребенка поствакцинальных осложнений на первую или вторую прививку в первые двое суток после введения АКДС-вакцины (температура 39° и выше, аллергическая сыпь, круп, судороги, шок и т.д.) дальнейшее применение этого препарата прекращают. Иммунизация может быть продолжена АДС-М-анатоксином, который вводят однократно; если ребенок получил две прививки АКДС-вакциной, то цикл вакцинации против дифтерии считают законченным.

 

Если у ребенка в связи с заболеваниями или другими причинами (карантин) после второй прививки прошло 12 месяцев и более, то курс вакцинации против упомянутых инфекций также считают законченным;

б) первую ревакцинацию АКДС-вакциной проводят однократно в дозе 0,5 мл через 1,5 - 2 года после законченной вакцинации.

Примечание:

1. Если у ребенка срок первой ревакцинации приходится на возраст старше 3-х лет (3 г., 11 мес. и 29 дней), то ее следует проводить не АКДС-вакциной, а АДС- или АДС-М-анатоксином через 1,5 - 2 года после законченной вакцинации в дозе 0,5 мл, так как дети старше 3-х лет иммунизации против коклюша не подлежат.

2. Если ребенок первую ревакцинацию АКДС-вакциной получил в возрасте старше 3-х лет, т.е. прививался вне схемы, то вторую ревакцинацию ему следует проводить с интервалом 9 - 10 лет АДС-М-анатоксином однократно в дозе 0,5 мл.

 

2. Адсорбированным дифтерийно-столбнячным (АДС) анатоксином прививают детей, имеющих противопоказания к введению АКДС-вакцины (см. наставление на АДС-М-анатоксин) и переболевших коклюшем.

а) Курс вакцинации АДС-анатоксином состоит из двух внутримышечных инъекций препарата с интервалом 45 дней (в дозе 0,5 мл каждая).

При необходимости удлинения интервала после первой прививки вторую следует проводить в возможно ближайший срок, определяемый состоянием здоровья ребенка.

В исключительных случаях, если после первой прививки прошло более года, курс вакцинации должен состоять из двух инъекций.

б) Первую ревакцинацию АДС-анатоксином проводят через 9 - 12 мес. после законченной вакцинации однократно в дозе 0,5 мл.

3. Адсорбированным дифтерийно-столбнячным анатоксином с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М) прививают детей с 3-х месяцев, имеющих противопоказания к введению АКДС-вакцины и АДС-анатоксина; детей старше 6-ти лет (6 лет, 11 мес., 29 дн.), по каким-либо причинам ранее не привитых против дифтерии. Кроме того, препарат используют для возрастных ревакцинаций детей и подростков, а также для иммунизации взрослых.

а) Курс вакцинации АДС-М-анатоксином состоит из двух внутримышечных инъекций препарата (в дозе 0,5 мл каждая) с интервалом 1,5 мес. При необходимости удлинения интервала после первой прививки вторую следует проводить в ближайший возможный срок, определяемый состоянием здоровья ребенка. Удлинение интервала между прививками, связанное с нарушением схемы, не должно превышать 11 мес.

В исключительных случаях, если после первой прививки прошло более года, курс вакцинации должен состоять из двух инъекций.

б) Первую ревакцинацию АДС-М-анатоксином проводят через 6 - 9 месяцев после законченной вакцинации АДС-М-анатоксином однократно в дозе 0,5 мл.

Примечание: Если ребенок из-за реакций на введение АКДС-вакцины при вакцинации получил две прививки АКДС-вакциной или разными препаратами: АКДС + АДС-М-анатоксином, то его считают вакцинированным против дифтерии и столбняка, и первую ревакцинацию проводят АДС-М-анатоксином через 1,5 - 2 года после второй прививки однократно в дозе 0,5 мл.

 

в) Вторую ревакцинацию проводят в возрасте 9 лет АДС-М-анатоксином однократно в дозе 0,5 мл.

Примечание: Если ребенок первую ревакцинацию АДС-М-анатоксином получил в возрасте старше 3-х лет, то вторую ревакцинацию ему проводят с интервалом в 6 - 7 лет. Последующие ревакцинации проводят с таким же интервалом.

 

г) Третью ревакцинацию проводят в возрасте 16 лет АДС-М-анатоксином однократно в дозе 0,5 мл.

Примечание: Если ребенок вторую ревакцинацию получил в 6 лет, то третью ревакцинацию ему следует сделать в 16 лет (а не в 11 лет) АДС-М-анатоксином однократно в дозе 0,5 мл.

 

д) Последующие ревакцинации проводят с интервалом 10 лет.

Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М) применяют также:

1) для вакцинации и ревакцинации серонегативных к дифтерии и столбняку детей и подростков (до 16 лет), выявленных по результатам определения состояния иммунитета в РПГА. Если у ребенка нет документального подтверждения проведенных прививок, то серонегативных к дифтерии и столбняку лиц иммунизируют двукратно с интервалом 45 дней в дозе по 0,5 мл; если у ребенка имеются сведения о прививках, то однократно, в дозе 0,5 мл с последующей (через 45 дней) постановкой РПГА. При отсутствии нарастания титров анатоксинов препарат вводят повторно в дозе 0,5 мл;

2) для иммунизации детей и подростков в возрасте до 16 лет, переболевших дифтерией, ранее не привитых или получивших одну прививку против дифтерии и столбняка. Их вакцинируют однократно АДС- или АДС-М-анатоксином в дозе по 0,5 мл, но не ранее чем через 6 мес. после перенесенного заболевания. Первую ревакцинацию им проводят с интервалом в зависимости от полученного препарата при вакцинации. Последующие ревакцинации им проводят с интервалом 6 - 7 лет.

Дети и подростки в возрасте до 16 лет, привитые против дифтерии (получившие законченную вакцинацию, одну или несколько ревакцинаций) и переболевшие локализованной формой дифтерии, без осложнений, дополнительной прививке против дифтерии через 6 месяцев после заболевания не подлежат. Ревакцинации им проводят в сроки согласно данной Инструкции.

Дети, привитые двукратно или более раз и перенесшие тяжелые и среднетяжелые формы дифтерии, должны быть привиты АКДС-вакциной, АДС- или АДС-М-анатоксином (в зависимости от возраста) однократно в дозе 0,5 мл, но не ранее чем через 6 месяцев после перенесенного заболевания. Последующие ревакцинации им следует проводить через 6 - 7 лет.

4. Адсорбированный дифтерийный анатоксин (АД-М) с уменьшенным содержанием антигена применяют:

а) при плановой ревакцинации лиц в возрасте 16 - 18 лет, не имеющих противопоказаний к введению пента- и секста-анатоксинов. Препарат вводят однократно в дозе 0,5 мл;

б) детям и подросткам, давших отрицательный результат в РПГА с дифтерийным диагностикумом и положительный - со столбнячным, не имеющим документального подтверждения проведенных прививок, препарат вводят двукратно с интервалом 45 дней в дозе по 0,5 мл. Если сведения о прививках имеются, то АД-М-анатоксин вводят однократно в дозе 0,5 мл;

в) при плановых ревакцинациях детям и подросткам, получившим адсорбированный столбнячный анатоксин в связи с травмой в период между ревакцинациями;

г) по эпидемическим показаниям взрослым - однократно в дозе 0,5 мл.

 

Активная иммунопрофилактика взрослых

 

Плановой иммунизации подлежит взрослое население в возрасте с 26 лет до 56 лет включительно. В первую очередь, подлежат прививкам лица, относящиеся к группам повышенного риска заболевания: проживающие в общежитиях, работники сферы обслуживания, медицинские работники, студенты, преподаватели и обслуживающий персонал школ, средних, специальных и высших учебных заведений, работники детских дошкольных учреждений.

Прививки против дифтерии взрослым проводят одновременно с иммунизацией против столбняка: АДС-М-анатоксином однократно в дозе 0,5 мл.

Повторные прививки против дифтерии взрослым проводят каждые 10 лет.

Примечание: Лиц, ранее привитых против столбняка, у которых после прививки прошло менее 10 лет, иммунизируют АД-М-анатоксином (однократно в дозе 0,5 мл), 10 лет и более - АДС-М-анатоксином.

 

 

СХЕМА

АКТИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ КОКЛЮША, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКА

 

Препараты						Примечание
Вакци- нация	Схема	АКДС-      вакцина    (против    коклюша,   дифтерии и столбняка)	АДС-       анатоксин  (против    дифтерии и столбняка)	АДС-М-     анатоксин  (против    дифтерии и столбняка)	АД-М-       анатоксин   (против     дифтерии)
		С 3-х мес. 3 прививки с интерва- лом 1,5    мес. в дозе 0,5 мл     каждая	С 3-х мес. 2 прививки с интерва- лом 1,5    мес. в дозе 0,5 мл     каждая	С 3-х мес. 2 прививки с интерва- лом 1,5    мес. в дозе 0,5 мл     каждая	Не проводят	1. Если у ребенка   возникло поствакци- нальное осложнение  на первую прививку  АКДС-вакциной или   АДС-анатоксином, то вторая прививка     может быть проведена АДС-М-анатоксином.  2. Если у ребенка   была поствакциналь- ная реакция на вто- рую прививку АКДС-  вакциной или после  нее по каким-либо   другим причинам     прошло 12 мес. и    более, то вакцинация считается           законченной
		Прививки проводят одновременно с вакцинацией    против полиомиелита
	Контин- генты	Дети, не   имеющие    противопо- казаний к  введению   АКДС-      вакцины    (см. на-   ставление к препарату)	Дети в     возрасте до 6 лет, пе- реболевшие коклюшем и не имеющие противопо- казаний к  применению АДС-       анатоксина (см. на-   ставление к препарату)	Дети, имею- щие проти- вопоказания к введению АКДС и АДС- анатоксина. Дети старше 6 лет (см. наставление к препара- ту)
Сроки ревак- цина- ции	1	Через 1,5 - 2 года     после      законченной вакцинации однократно в дозе 0,5 мл	Через 9 -  12 мес.    после      вакцинации однократно в дозе 0,5 мл	Через 6 - 9 мес. после вакцинации однократно в дозе 0,5 мл	Не проводят	Если ребенок        вакцинирован АКДС-  вакциной и у него   срок первой ревакци- нации приходится на возраст старше 3-х  лет (3 г., 11 мес., 29 дн.), то ее      следует проводить не АКДС-вакциной, а    АДС- или АДС-М-     анатоксинами через  1,5 - 2 года после  законченной вакцина- ции однократно в    дозе 0,5 мл, т.к.   дети старше 3-х лет иммунизации против  коклюша не подлежат
Сроки ревак- цина- ции	2	Не проводят	Не проводят	Однократно, 9 лет, в   дозе 0,5 мл	9 лет,      однократно в дозе 0,5 мл в случае    если ребенок получил АС- анатоксин в связи с     травмой в   период между первой и    второй ре-  вакцинациями	Если у ребенка      первая ревакцинация приходится на       возраст старше 3-х  лет, т.е. его приви- вают вне схемы, то  вторую ревакцинацию следует проводить с интервалом 6 - 7 лет при вакцинации      АДС-М-анатоксином и через 9 - 10 лет -  при вакцинации АКДС- вакциной
	3	Не проводят	Не проводят	Однократно, 16 лет, в  дозе 0,5 мл	16 лет,     однократно  в дозе 0,5  мл в случае если период между второй и третьей   ревакцинаци- ями был     получен АС- анатоксин в связи с     травмой	Если ребенок вторую ревакцинацию получил в 6 лет, то третью  ревакцинацию прово- дят не в 11 лет, а в 16 лет
	4			Последующие ревакцина- ции прово- дят каждые 10 лет в   возрасте   26, 36, 46, и 56 лет   (включи-   тельно) в  дозе 0,5 мл	Ревакцинации взрослым,   если после  последней   прививки    против      столбняка не прошло менее 10 лет,     однократно в дозе 0,5 мл

 

 

Заместитель начальника Главного

управления карантинных инфекций

Минздрава СССР

М.И.НАРКЕВИЧ

 

 

 

 

 

Приложение 4

к Приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 2 апреля 1986 г. N 450

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ПРОВЕДЕНИЮ ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ

В ОЧАГЕ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

 

Целью проведения противоэпидемических мероприятий в очаге дифтерийной инфекции является локализация и ликвидация очага.

Основной задачей противоэпидемических мероприятий является своевременное выявление больных дифтерией, больных с подозрением на дифтерию, носителей токсигенных коринебактерий, лиц с патологией ЛОР-органов, лиц не защищенных против дифтерии.

При получении экстренного извещения - форма 058/у - врач-эпидемиолог в тот же день проводит эпидемиологическое обследование очага инфекции и назначает все необходимые мероприятия.

 

1. Установление подозреваемого источника инфекции

 

При опросе больного и соприкасавшихся с ним лиц выясняют его контакты в предшествующие 7 дней с больными дифтерией и с подозрением на нее, а также ангиной, паратонзиллярным абсцессом, мононуклеозом, крупом; пребывание в местностях, где были заболевания дифтерией (не менее чем за последний месяц).

В городских поликлиниках, в поликлинических отделениях центральной районной больницы (ЦРБ) и сельских участковых больниц, на фельдшерско-акушерском пункте (ФАП) проверяют (не менее чем за месяц до заболевания дифтерией) истории развития ребенка (форма 112/у), медицинские карты амбулаторного больного (форма 025/у) и журналы регистрации амбулаторных больных.

В детских учреждениях, ПТУ, техникумах, на производстве проверяют табель посещаемости, медицинские справки на отсутствующих, журнал больных в изоляторе, больничные листы персонала и т.п. за месяц, предшествующий заболеванию дифтерией.

Лица с подозрением на дифтерию, выявленные при проверке указанной документации, должны быть осмотрены специалистами (ЛОР-врачом, инфекционистом), обследованы бактериологически и при наличии клинических показаний госпитализированы.

Если эпидемиологическим обследованием установлено, что заражение произошло вне данной местности, об этом необходимо срочно сообщить органам здравоохранения, откуда прибыл больной для принятия там соответствующих мер.

 

2. Выявление лиц, контактировавших с больными дифтерией

(носителями токсигенных коринебактерий дифтерии)

и установление границ очага

 

Предусматривают выявление всех лиц, соприкасавшихся с больным (носителем токсигенных коринебактерий дифтерии) по месту жительства, учебы, работы, в детском учреждении и назначают бактериологическое обследование их и медицинское наблюдение за ними в течение 7 дней с момента изоляции больного или носителя.

При выявлении случая заболевания или носительства токсигенных коринебактерий дифтерии должны быть установлены связи: в комнате, квартире, подъезде, общежитии и т.п.; в организованных коллективах детей и подростков - в целом по учреждению, в коллективах взрослых (студентов, служащих, рабочих и др.) в зависимости от местных условий - общежитие, служебная комната, цех и т.п. Должны быть также учтены родственные и дружеские связи. К определению контактировавших в границах очага следует привлекать местных медицинских работников и администрацию.

По контакту с больным или носителем токсигенных коринебактерий дифтерии немедленно проводят одномоментное, однократное бактериологическое обследование, начиная с лиц, непосредственно общавшихся с больным (группа, класс, группа продленного дня, комната общежития), и лиц с ЛОР-паталогией, выявленных во всем коллективе (детские учреждения, школы, этаж или корпус общежития). В течение недели следует закончить однократное обследование всего коллектива.

В случае выявления после первого бактериологического обследования носителей токсигенных коринебактерий дифтерии обследования продолжают до прекращения выявления носителей токсигенных коринебактерий дифтерии.

Бактериологическое исследование необходимо совместить с осмотром обследуемых ЛОР-специалистами. Забору материала из зева и носа для исследования у лиц с хронической патологией ЛОР-органов следует уделять особое внимание. Бактериологическому обследованию подлежат также лица с различными кожными поражениями (фурункулы, пиодермия, длительные экскориации и корочки, панарации и т.п.).

Окончательные границы очага определяют после получения всех сведений и результатов бактериологического и серологического обследования.

 

3. Мероприятия, направленные на источник инфекции

 

Больные дифтерией или с подозрением на нее подлежат немедленной госпитализации (боксы, отдельные палаты инфекционных отделений больниц, провизорные отделения).

В очаге дифтерийной инфекции заболевание ангиной с наложениями или крупом рассматривают как подозрение на дифтерию. Эти больные из очага дифтерийной инфекции подлежат провизорной госпитализации.

Носители токсигенных коринебактерий дифтерии (дети и взрослые) подлежат госпитализации в инфекционные отделения. При поступлении в отделение до начала антибиотикотерапии их дважды обследуют бактериологически с интервалом в один день. В санации носителей основное значение имеет выявление и лечение хронической патологии ЛОР-органов, которая является одним из факторов, способствующих длительному бактериовыделению. С этой целью все бактерионосители должны быть консультированы врачом-отоларингологом.

Лечение хронической патологии ЛОР-органов проводят по назначению врача-отоларинголога с первых дней пребывания в стационаре.

Антибиотики (тетрациклин, эритромицин, левомицетин) назначают по усмотрению врача и только после повторного высева токсигенных коринебактерий дифтерии. Курс лечения продолжается от 5 до 7 дней, дозы возрастные. Кроме того, проводится симптоматическая и общеукрепляющая терапия. При получении 2-х отрицательных результатов исследования (с интервалом 1 - 2 дня) на дифтерию лечение его продолжают по месту жительства, о чем следует указать в справке при выписке из стационара.

Изоляцию носителей токсигенных коринебактерий дифтерии прекращают после двухкратного бактериологического обследования с отрицательным результатом, проводимого с интервалом в 1 - 2 дня и не ранее чем через 3 дня после отмены антибиотиков. При повторном и длительном высеве лечение продолжается в стационаре (активное лечение хронической патологии ЛОР-органов вплоть до тонзиллоэктомии, физиотерапия, лечение дисбактериоза).

Вопрос о допуске в коллектив взрослых или детей и подростков носителя с затяжным выделением токсигенных коринебактерий дифтерии, продолжающимся несмотря на проведение 2-х курсов санации, решается комиссионно с участием эпидемиолога, педиатра (терапевта) и врача-отоларинголога при условии создания в коллективе прочной иммунной прослойки. За коллективом, куда допущен носитель, наблюдение эпидемиолога и педиатра (терапевта) продолжается до прекращения носительства. При этом проводят бактериологическое обследование носителя и контактных (детей и взрослых) один раз в две недели, а также периодические медицинские осмотры. В период пребывания в коллективе носителя токсигенных коринебактерий дифтерии вновь принимают только иммунных лиц (детей и взрослых).

В некоторых случаях по усмотрению эпидемиологов возможна санация носителей токсигенных коринебактерий дифтерии на месте без их госпитализации. Это относится к коллективам (школы-интернаты, д/дома с численностью не более 300 человек) полностью привитых детей и подростков. Такая необходимость может возникнуть при одномоментном выявлении в коллективе 10 - 15% и более носителей токсигенных дифтерийных бактерий.

Должны быть учтены практические возможности осуществления этого мероприятия; ежедневное врачебное наблюдение, в том числе врачом-отоларингологом, и термометрия; санация носителей и лиц с хронической патологией ЛОР-органов; провизорная госпитализация всех лиц с острыми воспалительными явлениями в носоглотке; бактериологическое обследование детей (1 раз в 2 недели) и персонала (каждую неделю); обеспечение иммунологической защиты неиммунных к дифтерии взрослых. Взрослых носителей токсигенных коринебактерий дифтерии из коллектива изолируют. В этот период рекомендуется ужесточить требования к санитарно-гигиеническому режиму, обеспечить рациональное питание, назначение витаминов, длительное пребывание детей на воздухе.

Носители нетоксигенных коринебактерий дифтерии не подлежат госпитализации и лечению антибиотиками. Им проводят консультацию врача-отоларинголога с целью диагностики и лечения хронической патологии ЛОР-органов по месту жительства.

О каждом вновь выявленном больном, носителе токсигенных коринебактерий дифтерии в СЭС направляют экстренное извещение (форма 058/у).

Работники санитарно-эпидемиологической станции проводят эпидемиологическое обследование очага дифтерийной инфекции с заполнением карты эпидемиологического обследования очага инфекционного заболевания (форма 357/у).

В сельском населенном пункте при регистрации тяжелого или повторного заболевания дифтерией назначают ежедневные обходы силами средних медицинских работников под руководством врача для выявления всех температурящих больных и их госпитализации (провизорная госпитализация).

В коллективе (детском учреждении, школе, ПТУ и др.) после последнего посещения заболевшего в течение 7 дней проводят ежедневную термометрию и врачебный осмотр детей, подростков и персонала. С целью выявления среди них больных дифтерией носа, выявления и лечения больных хроническим тонзиллитом в стадии обострения необходимо проводить не реже одного раза в три дня осмотр врачом-отоларингологом.

 

4. Мероприятия, направленные на создание

противодифтерийного иммунитета

 

Для предупреждения распространения заболеваний дифтерией с целью повышения иммунной прослойки необходимо проводить иммунизацию контактировавших детей и взрослых.

Немедленно прививкам подлежат дети, у которых наступил срок очередной вакцинации или ревакцинации. Всех контактировавших в возрасте до 16 лет и старше (без ограничения возраста), не получавших прививок в течение последних 10 лет и не имеющих медицинских противопоказаний к прививкам, прививают АД-М- или АДС-М-анатоксином однократно в дозе 0,5 мл. Для выявления неиммунных лиц среди остальных контактировавших в возрасте от 3 до 16 лет срочно исследуют их сыворотки в РПГА. Все выявленные неиммунные лица (с титром менее 0,03 МЕ/мл) подлежат немедленной иммунизации.

 

5. Составление плана противоэпидемических

мероприятий по ликвидации очага

 

С учетом полученных данных о возможном источнике инфекции, состоянии активной иммунизации, определении границ очага эпидемиологи составляют план противоэпидемических мероприятий по ликвидации очага инфекции. Реализацию плана, составленного конкретно по датам, осуществляют санэпидслужба и лечебно-профилактические учреждения. План утверждает горздравотдел (райздравотдел), главный врач ЦРБ.

План содержит разделы.

Организационные мероприятия предусматривают:

а) выделение дополнительного медперсонала (врачей и средних медицинских работников) для подворных обходов по выявлению больных, взятия проб крови для серологических обследований в РПГА, для проведения активной иммунизации (главный врач лечебно-профилактического учреждения);

б) проверку состояния активной иммунизации на всех врачебных и фельдшерских участках районов данной административной территории (главный врач санэпидстанции);

в) выделение коек для провизорной госпитализации больных ангинами и носителей токсигенных дифтерийных бактерий (главный врач больницы);

г) определение объема бактериологических обследований на дифтерию (эпидемиолог), обеспечение своевременного взятия и доставки материала для исследования (главные врачи лечебно-профилактических учреждений);

д) постановка РПГА (главный врач санэпидстанции);

е) выделение дополнительного транспорта (при необходимости) (главные врачи лечебно-профилактических учреждений и санэпидстанций).

Все мероприятия, предусмотренные планом, должны проводить одновременно и оперативно.

При неблагополучной эпидемической ситуации следует создать медицинский штаб с участием советских органов для обеспечения проведения всех мероприятий и контроля за их выполнением.

 

6. Санитарно-просветительная работа

 

Санитарное просвещение должно быть направлено на разъяснение населению необходимости выполнения всех рекомендаций медицинских работников, включающих своевременное обращение и госпитализацию больных дифтерией, с подозрением на эту инфекцию, больных ангиной; проверку уровня антитоксического иммунитета у контактировавших с больными; проведения прививок.

При этом должны быть использованы все доступные методы: лекции, беседы в учреждениях и на дому, выступление по радио, телевидению, в местной печати, привлечение к санитарно-просветительной работе по дифтерии всех медицинских работников.

Необходимо также широко использовать в работе по ликвидации очага дифтерии санитарный актив.

 

Заместитель начальника Главного

управления карантинных инфекций

Минздрава СССР

М.И.НАРКЕВИЧ

 

 

 

 

 

Приложение 5

к Приказу Министерства

здравоохранения СССР

от 2 апреля 1986 г. N 450

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ И СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ

ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИИ И ЕГО ТОКСИНА

 

В настоящих инструктивных материалах представлены методики, позволяющие практическим бактериологам на современном этапе борьбы с дифтерийной инфекцией на качественно новом уровне выявлять и определять возбудителя этой инфекции и его токсин.

Проведение противоэпидемических мероприятий, специфического лечения с целью предупреждения летальных исходов диктуют необходимость осуществления своевременной бактериологической диагностики при дифтерийной инфекции. Выявление возбудителя при легко протекающих заболеваниях, отличающихся трудностью клинической диагностики, получение материалов, характеризующих интенсивность циркуляции возбудителя дифтерии среди населения в различных эпидемических и иммунологических условиях, изучение его биологических свойств - необходимый круг вопросов, решаемый в системе эпидемиологического надзора бактериологами.

Необходимо помнить, что постановка диагноза, определение необходимости введения противодифтерийной сыворотки больному осуществляются врачами лечебных учреждений, бактериологическое обследование в этих случаях может явиться дополнительным методом, позволяющим клиницисту поставить диагноз дифтерии, но не отвергать его только на основании отрицательной бактериологии. В этой связи бактериологам необходимо использовать все методы, ускоряющие бактериологический ответ и дающие возможность выдачи предварительного ответа на первом этапе бактериологического исследования.

Питательные среды, определяющие рост уже через 24 часа, МБС (микроскоп бинокулярный стереоскопический) для изучения колоний (даже мелких, через 24 часа), постановка пробы на токсигенность в первые сутки роста колоний на чашках с первичным посевом, ряд усовершенствованных ускоренных методик идентификации - вот тот неполный перечень условий, способствующих выдаче предварительного ответа уже на 1 - 2 сутки от начала исследования и окончательного ответа при выделении возбудителя дифтерии (токсигенных коринебактерий дифтерии) на третьи сутки исследования.

В последующие дни (4 - 5 сутки) могут быть добавлены сведения о биохимических свойствах возбудителя дифтерии или выдан бактериологический ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии. При изучении циркуляции возбудителя и его биологических свойств выдачи предварительного ответа не требуется и бактериологическое исследование занимает 3 - 5 суток. Отрицательный бактериологический ответ может быть выдан на 2-е или 4-е сутки от начала исследования.

 

Характеристика микроорганизмов рода Corynebacterium

 

К роду Corynebacterium относится много видов микроорганизмов, таксономическое положение некоторых из них очень близко к виду Corynebacterium diphtheriae. Известна гетерогенность вида C. diphtheriae, что заставляет некоторых исследователей делить этот вид на подвиды и даже выделять по некоторым признакам коринебактерий "новые" виды. В основном, таксономические споры касаются нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Отечественными и международными номенклатурными комитетами утвержден вид Corynebacterium diphtheriae, куда входят токсигенные (возбудитель дифтерии) и нетоксигенные коринебактерии дифтерии, которые заболеваний с клиническими проявлениями дифтерии не вызывают.

Два широко распространенных вида C. xerosis и C. pseudodiphtheriu (ложно-дифтерийная палочка Гофмана - C. hofmanui) часто обитают в организме человека. Многие дифтероиды - широко распространенные сапрофиты, поэтому ориентировочным критерием оценки качества работы бактериологов может служить умение выделять некоторые дифтероиды со слизистых человека. C. ulcerans - природный патоген крупного рогатого скота (вызывает маститы у коров). Возможность заражения человека C. ulcerans крайне низка. Однако известны случаи, когда при клинической картине заболевания, схожей с дифтерией, выделены C. ulcerans токсигенные, такие больные чаще проживали в сельской местности и имели контакт с больными животными. Представляют интерес данные по распространенности этого микроба на территории СССР.

Все микроорганизмы рода Corynebacterium являются грамположительными палочками, не образующими спор, обладающими различной степенью плеоморфизма (разнообразие форм), гетеротрофы, большинство видов растет лучше в аэробных условиях.

Обычно колонии из рода коринебактерий на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) окрашены в белый или желтоватый цвет, непрозрачны, имеют округлую форму, диаметр 1 - 3 мм. Чаще всего они бывают мягкой маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода коринебактерий могут образовывать хрупкие шероховатые R-колонии. Многие виды этого рода образуют яркие пигменты. Представители этого рода не отличаются высокой ферментативной активностью. C. diphtheriae растут при 37°, устойчивы к низкой температуре, чувствительны к высокой. Все дезинфицирующие вещества в обычных концентрациях (3 - 5%) убивают коринебактерии дифтерии (через 20 - 30 минут). Токсигенные C. diphtheriae более чувствительны к антибиотикам, чем нетоксигенные. Возможно появление устойчивых к антибиотикам штаммов. Широко определять чувствительность штаммов, выделенных от бактерионосителей, к антибиотикам не следует из-за несоответствия результатов лабораторной пробы с действием антибиотиков в организме человека на возбудителя дифтерии.

Для морфологии C. diphtheriae характерно: большое разнообразие в длине клеток - от коротких кокковидных до тонких булавовидных, плеоморфизм - клетки имеют форму булавы, сперматозоида, ракетки, овоида и т.д., беспорядочное расположение, напоминающее римские цифры X, Y, наличие гранул; возможна выраженная внутриклеточная исчерченность, что является, очевидно, скоплением зерен волютина. Описано средство волютина к метиленовому синему, и при обработке клеток этим красителем гранулы или полоски - скопления гранул - прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. В "Инструкции" описаны методики приготовления красителей (синих) для окраски мазков. В бактериологической практике нецелесообразно красить по Граму или другими сложными методами для выявления волютина, так как непроявившиеся свойства могут неправильно трактоваться бактериологами.

Для C. ulcerans и C. hofmanni характерна особенность в расположении отдельных клеток - склонность к параллелизму. 24 - 48-часовые культуры этих видов имеют чаще всего кокковидную и овоидную формы.

По структуре колоний и некоторым биохимическим свойствам C. diphtheriae подразделяются на так называемые колониальные или культурально-биохимические варианты - gravis, mitis, intermedius.

Через 48 - 72 часа роста S-колонии обычно связаны с вариантом, гладкие, возвышенные, 1 - 2 мм; S-R колонии - вариант gravis обычно плоские, морщинистые, с приподнятым центром, диаметром 2 - 3 мм; мелкие колонии S типа - intermedius плоские, гладкие диаметром 0,5 - 1 мм. Описаны фильтрующиеся формы C. diphtheriae. В "Инструкции" описаны два культурально-биохимических варианта - gravis и mitis, так как intermedius встречается крайне редко и по способности ферментировать крахмал соответствует mitis варианту.

Необходимо отметить, что не существует корреляции между культурально-биохимическим вариантом gravis и mitis токсигенных штаммов и тяжестью клинических симптомов дифтерии. Более широкое распространение в последние годы C. diphtheriae биохимического варианта mitis у больных дифтерией, в том числе среди взрослых, не может служить причиной возникновения заболеваний дифтерией среди взрослого населения. Последнее связано с отсутствием противодифтерийного антитоксического иммунитета.

На кровяных теллуритовых средах через 48 час. роста колонии C. diphtheriae варианта gravis сходны с колониями C. ulcerans - черные, матовые, имеют радиальную исчерченность, у C. hofmanni появляется характерный светлый ободок. В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства колоний или микробной клетки (ее форму, окраску) при идентификации микроорганизмов рода коринебактерий не представляется возможным. Описаны случаи бактериологической гиподиагностики в 55% и 14,5% случаев гипердиагностики при идентификации только по морфологическим свойствам. При идентификации C. diphtheriae в бактериологической диагностике необходимо использовать комплекс тестов, в первую очередь, определение патогенности (токсигенности), основного признака возбудителя заболевания. И хотя представители рода Corynebacterium не отличаются высокой ферментативной активностью, определение некоторых биохимических свойств облегчает их идентификацию (см. табл.).

 

ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОРИНЕБАКТЕРИЙ,

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В СИСТЕМЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ C. DIPHTHERIAE

 

┌──────────────┬───────────────┬───────────────────────────┬──────────────┐

│     Вид      │  Токсигенные  │        Разложение         │Восстановление│

│коринебактерий│   свойства    ├────┬────┬─────┬─────┬─────┤  нитратов в  │

│              │(с противодифт.│цис-│глю-│саха-│крах-│моче-│   нитриты    │

│              │антитоксической│тина│козы│розы │мала │вины │              │

│              │  сывороткой)  │    │    │     │     │     │              │

│              │   in vitro    │    │    │     │     │     │              │

├──────────────┼───────────────┼────┼────┼─────┼─────┼─────┼──────────────┤

│C. diphtheriae│+/-            │+   │+   │-    │+    │-    │+             │

│вариант гравис│               │    │    │     │     │     │              │

│C. diphtheriae│+/-            │+   │+   │-    │-    │-    │+/-           │

│вариант митис │               │    │    │     │     │     │              │

│C. ulcerans   │+/-            │+   │+   │-    │+    │+    │-             │

│C. hofmanni   │-              │-   │-   │-    │-    │+    │+             │

│C. xerosis    │-              │-   │+   │+    │-    │-    │+             │

└──────────────┴───────────────┴────┴────┴─────┴─────┴─────┴──────────────┘

 

Определение токсигенных свойств является основной дифференциально-диагностической пробой при бактериологическом исследовании на дифтерию и проводится бактериологами в первые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичного посева материала.

С целью выдачи предварительного бактериологического ответа в Инструкции предусмотрен ускоренный метод индикации токсина - реакция нейтрализации антител (РНАт) с коммерческим дифтерийным антигенным (анатоксинным) эритроцитарным диагностикумом (ДАгЭД). Предварительный бактериологический ответ способствует раннему (на несколько суток) введению противодифтерийной антитоксической сыворотки при необходимости больным дифтерией и своевременному проведению противоэпидемических мероприятий в очаге инфекции.

    Обязательным  является  иммуно-химический  тест  на  токсигенность  (in

vitro)   -   реакция  диффузионной  преципитации  в  агаре,  основанная  на

взаимодействии  дифтерийного  экзотоксина  и  антител из противодифтерийной

антитоксической  сыворотки.  Часто  бытующее  мнение среди бактериологов об

утрате   токсигенных  свойств  штаммами  коринебактерий  дифтерии  является

неверным,  хотя  приобретение  этих  свойств,  явление  фаговой  конверсии,

известно уже давно, но только при специальном экспериментальном воздействии

                                        +

на токсигенные штаммы конвертирующим tox  фагом, в эпидпроцессе это явление

не   показано.   В   бактериологической   практике,  когда  при  ангинах  с

наложениями,  леченных  антибиотиками,  при  первичном  посеве исследуемого

материала   выделяют   токсигенные,   а   при   повторных  обследованиях  -

нетоксигенные  коринебактерии дифтерии, можно предположить, что при лечении

антибиотиками скорее исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные,

а нетоксигенные продолжают выделяться. Такое же положение может создаваться

и  при  санации антибиотиками бактерионосителей, одновременно токсигенных и

нетоксигенных  коринебактерий дифтерии. Выделение у таких бактерионосителей

при  повторных обследованиях только нетоксигенных штаммов нельзя трактовать

как утрату способности штаммов продуцировать экзотоксин.

Для избежания ошибок в определении токсигенных свойств необходимо их изучение у максимального числа выросших колоний на чашках с первичным посевом. При соблюдении техники постановки пробы на токсигенность, описанной в данной Инструкции, на одной чашке можно изучить 20 подозрительных колоний из одного анализа. Нельзя изучать материал при множественном росте подозрительных колоний только в одной, двух бляшках.

Ферментативная активность микроорганизмов изучается по 2-м тестам - определение фермента цистиназы и уреазы, в редких случаях, когда необходимо идентифицировать C. ulcerans, добавляется тест-восстановление нитратов в нитриды. Среды Гисса (пестрый ряд) используются в коротком варианте: глюкоза, сахароза, крахмал.

Таким образом, идентификация C. diphtheriae основывается на определении токсигенных свойств, некоторых биохимических свойств (расщепление глюкозы, крахмала, наличие фермента цистиназы, отсутствие фермента уреазы) с учетом морфологии клетки (при необходимости) и колоний.

В Инструкции представлена методика по изучению серологических свойств коринебактерий дифтерии. Следует отметить, что в предшествующие годы на территории СССР были распространены токсигенные штаммы 2 сероварианта, некоторые нетоксигенные штаммы также принадлежали к этому сероварианту. Однако большинство нетоксигенных штаммов имели штаммовые различия по серологическим свойствам.

Для установления эпидемиологических связей в очаге дифтерийной инфекции между спорадическими и групповыми заболеваниями, а также выявление возможных случаев реинфекции целесообразно использовать метод определения серологических и фаговых вариантов коринебактерий дифтерии.

 

Организационно-методическая работа

бактериологических лабораторий

 

Бактериологические лаборатории республиканских, краевых, областных и городских (в городах с районным делением) СЭС являются методическими центрами по бактериологической диагностике:

- организуют подготовку специалистов-бактериологов с высшим и средним медицинским образованием с обязательным использованием штаммов коринебактерий дифтерии и постановкой контрольных задач;

- осуществляют контроль за работой лабораторий по бактериологической диагностике дифтерийной инфекции в районах и городах;

- контролируют правильность идентификации штаммов коринебактерий дифтерии, полученных из лабораторий районов, городов;

- проводят бактериологический контроль всех серий коммерческих питательных сред и ингредиентов, а также контроль содержания аминного азота в средах, приготовленных в лабораторных условиях;

- в каждой лаборатории республики, края, области, района должен быть контрольный токсигенный штамм коринебактерий дифтерии.

Баклаборатории городских, районных СЭС, объединенных и больничных:

- организуют постоянное получение крови или кровяных смесей для работы, используя местные ресурсы;

- обучают специалистов больниц, поликлиник (терапевтов, отоларингологов, инфекционистов, хирургов, медицинских сестер процедурных кабинетов, инфекционных отделений) и работников СЭС, осуществляющих сбор материала, правильному взятию, а при необходимости и посеву исследуемого материала;

- контролируют наличие термостатов и холодильников в ЛПУ;

- осуществляют контроль за своевременным обновлением питательных сред, тампонов в ЛПУ, а также за правильностью доставки материала в лаборатории.

 

Бактериологическое исследование

 

Взятие и доставка материала

 

1. Успех бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного и правильного взятия материала для исследования. От больных ангинами и с подозрением на дифтерию сбор материала необходимо проводить в течение 3 - 4 часов (не позднее 12 часов) с момента обращения в ЛПУ.

2. При исследовании на дифтерию обследуют носоглотку, при этом во всех случаях берут слизь и пленки с миндалин из зева и носа. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище), помимо пораженных участков, следует брать материал также с миндалин и из носа.

3. Взятие материала должны производить специально обученные медицинские работники.

При бактериологическом обследовании с диагностической целью материал для исследования берут работники ЛПУ. При обследовании по эпидемиологическим показаниям, при работе в очаге дифтерийной инфекции - работники СЭС или специально созданные и обученные бригады.

4. Для взятия материала используют стерильные ватные сухие тампоны. Материал с миндалин и из носа берут отдельными тампонами натощак или не ранее чем через 2 часа после еды при хорошем освещении с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка, слизистой щек и зубов. При наличии налетов материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют один тампон, который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи.

При проведении курса лечения антибиотиками или другими антибактериальными препаратами материал следует брать не ранее чем через 3 дня после окончания лечения, чтобы исключить их бактериостатическое действие на возбудителя дифтерии.

5. Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов после взятия материала. При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, в поликлиниках или стационарах, когда посев будет произведен позже 3-х часов с момента взятия материала, рекомендуют засевать материал на чашки с питательной средой или использовать транспортную среду. В случае использования транспортной среды материал собирают сухим тампоном на деревянной основе или на проволоке из нержавеющего металла, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокла. Применение транспортной среды удлиняет срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, но позволяет ставить РНАт для предварительного ответа.

    При  транспортировке  на дальние расстояния можно использовать тампоны,

предварительно смоченные  5-процентным  раствором  глицерина  (5-процентный

раствор глицерина готовят на физиологическом растворе, pH доводят до  7,6 с

помощью  20-процентного  раствора  Na HPO ).  Тампоны  перед  употреблением

                                     2   3

смачивают  из  общего  флакона  с  глицерином,  опуская  тампон во флакон и

отжимая лишнюю жидкость о стенки флакона. Тампоны,  смоченные  5-процентным

глицерином, можно стерилизовать только в автоклаве при  температуре 112°  в

течение 30 мин.

Материал, засеянный на чашки или в транспортную среду, доставляют в баклаборатории в осенне-зимнее время года в сумках с грелками.

6. В случае необходимости постмортальных исследований на коринебактерии дифтерии материал целесообразно брать с миндалин, гортани и полости носа. Учитывая, что дифтерия является токсикосептической инфекцией, нахождение возбудителя во внутренних органах крайне редко в отличие от других септических заболеваний.

7. Пробирки четко маркируют, указывая зев (з) и нос (н), скрепляют вместе от каждого лица и придают номер в соответствии с прилагаемым списком, где указываются фамилия, имя, происхождение материала (зев, нос или другая локализация), название учреждения, направляющего материал, или домашний адрес, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование и пр.), время взятия материала.

 

Ход исследования

 

Первый день

Посев материала

Материал для исследования из зева с миндалин, из носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри.

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом одну половину поверхности среды для посева из зева с миндалин, а вторую - для посева из носа. При посеве материала с кожи или других мест добавляют еще одну чашку. Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 х 1 кв. см, а затем этим же тампоном засевают круговыми движениями, втирая в поверхность среды. Такой метод посева позволяет засеять весь материал с тампона, получить изолированные колонии (чистую культуру) непосредственно с чашки для дальнейшей идентификации, что сокращает длительность анализа на одни сутки. Засеянные чашки или пробирки с транспортной средой помещают в термостат при 37°. Высев из транспортной среды производят на следующие сутки на плотные питательные среды тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.

Посев следует производить на среды, согретые при комнатной температуре или в термостате (15 - 20 мин.).

Второй день

1. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часа после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляют точно через 24 часа, т.е. тоже во второй половине дня) с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС, окуляр 6 и увеличение 2 объектива Галилеевой системы линз).

2. Чашки с подозрительными колониями на коринебактерии дифтерии отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопии препаратов-мазков с подозрительных колоний можно не проводить. Подозрительные колонии на кровяно-теллуритовых средах через 24 часа светло-серого цвета, выпуклые, с ровными краями, вязкие, через 48 часов - серые с металлическим оттенком, с ровными или слегка изрезанными краями, вязкие или ломкие при прикосновении петли. На среде Бучина подозрительные колонии имеют синий цвет (с различными оттенками - от серовато-зеленоватого до фиолетового), а среда на месте их роста приобретает фиолетовый оттенок.

3. Из сомнительных колоний готовят препараты-мазки. Коринебактерии дифтерии, выросшие на средах с ингибиторами роста (теллурит калия, хинозол), могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются. Морфологические признаки не позволяют установить видовую принадлежность микроорганизма, но дают возможность предположительно отнести их к роду коринебактерий. Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то эти колонии отбираются для дальнейшей идентификации по всем тестам.

Обнаружение при микроскопии чистых культур кокков, дрожжей, споровых палочек и т.д. позволяет прекратить дальнейшее изучение колоний.

При работе должны пользоваться бактериологической петлей диаметром 1 - 2 мм.

4. В случае роста подозрительных однотипных колоний необходимо сразу же приступить к изучению их по ряду тестов идентификации (токсигенные свойства, определение цистиназы) и выделить чистую культуру на скошенный сывороточный агар. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности необожженной петлей на среду Пизу, а другой половины колонии - в пробирку со скошенным вывороточным агаром для размножения и сохранения этой культуры. Учитывая, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности коринебактерий дифтерии, рекомендуется при множественном росте подозрительных колоний изучать токсигенные свойства по возможности у максимального числа колоний (10 - 20 колоний, смешивая 5 - 6 колоний в одну бляшку).

5. При проведении диагностических исследований в случае множественного роста подозрительных колоний с целью выдачи предварительного ответа можно поставить РНАт, дополнительную пробу Заксе (3 - 5 однотипных колоний, учет через 30 минут инкубации) и пробу Пизу (5 - 6 однотипных колоний, учет через 3 часа инкубации). При характерной для коринебактерий дифтерии морфологии колоний в МБС, морфологии культуры, отрицательной пробе Заксе, положительной пробе Пизу, выявлении токсина в РНАт можно выдать предварительный ответ через 24 часа (или через 48 часов) с момента первичного посева исследуемого материала об обнаружении культуры, подозрительной на коринебактерии дифтерии.

6. Если вырастает только одна колония, ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петли, - в столбик среды для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификации материал можно брать с бляшками через 48 часов роста или через 24 часа при выявленных токсигенных свойствах культуры.

7. Чашки с первичным посевом исследуемого материала вновь помещают в термостат на 24 часа и просматривают их повторно.

Третий день

1. Через 24 часа при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ.

При отсутствии специальных линий преципитации на среде для определения токсигенности чашки инкубируют еще 24 часа.

2. Культуру, выделенную на скошенный сывороточный агар (после определения ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (сахароза, глюкоза, крахмал) и фермента уреазы (гидролиз мочевины).

3. Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают повторно через 36 - 38 часов инкубации в термостате с помощью МБС. При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

При наличии подозрительных колоний проводят идентификацию культуры, определяют токсигенные свойства, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенный сывороточный агар (см. п. 1 второго дня исследования).

4. При отсутствии подозрительных колоний выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не обнаружены.

Четвертый день (или пятый)

1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 часа пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева), положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ (см. п. 1 третьего дня исследования).

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре (выделенную с чашки в случае 48-часового роста), после определения ее чистоты засевают на среды для определения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, бульон с мочевиной или проба Заксе).

3. Повторно (через 48 часов) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной на 2-й день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности, поставленных в 3-й день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 часов постановки токсигенности, но при положительной пробе на цистиназу, глюкозу, отрицательной пробе на уреазу и сахарозу культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии нетоксигенные с указанием биохимического варианта.

При выделении токсигенных коринебактерий дифтерии дополнительно выдают ответ о биохимических свойствах (через 72 часа или 96 часов с момента первичного посева исследуемого материала).

 

Бактериологическое заключение

 

1. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отсутствие гидролиза мочевины (проба на уреазу), характерные культуральные и другие биохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал) позволяют заключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерий дифтерии, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.

2. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отсутствие гидролиза мочевины, характерные культурные и другие биохимические свойства позволяют заключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерий дифтерии, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.

3. При наличии линий преципитации, идентичных (сливающихся) специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии положительных проб на уреазу, на цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствие ферментации сахарозы, редукции нитратов в нитриты культуру относят к виду коринебактерий ульцеранс, токсигенный вариант. Эти штаммы следует направлять в головное учреждение для дальнейшего изучения.

При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для коринебактерий ульцеранс, выделенную культуру относят к виду коринебактерий ульцеранс, но бактериологический ответ считают отрицательным.

4. При идентификации культуры как коринебактерий Гофмана или других дифтероидов бактериологический ответ считают отрицательным.

 

Схема бактериологического исследования

 

Первый день

Посев исследуемого материала на одну из питательных сред, рекомендованных инструкций, и инкубирование в термостате при 37°.

Второй день (24 часа)

1. Изучение выросших колоний, постановка пробы на токсигенность и цистиназу, выделение культуры на скошенный сывороточный агар.

2. При диагностическом обследовании и по эпидемиологическим показаниям в случае необходимости проводят исследования для выдачи предварительного ответа об обнаружении коринебактерий дифтерии (или токсина в РНАт).

Третий день (48 часов)

1. Учет результатов токсигенности и пробы на цистиназу, поставленных во второй день исследования. В случае наличия специфических линий преципитации выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Посев чистой культуры, выделенной во второй день исследования для изучения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

3. Повторный просмотр (через 48 часов) чашек первичного посева (от 1-го дня исследования) с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность, цистиназу и выделение чистой культуры на скошенный сывороточный агар. При диагностических исследованиях и по эпидемиологическим показаниям может быть выдан предварительный ответ об обнаружении коринебактерий дифтерии (или токсина в РНАт).

4. Выдача бактериологического ответа об отсутствии коринебактерий дифтерии.

Четвертый день (72 часа)

1. Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в 3-й день исследования через 48 часов роста первичного посева, и выдача документированного ответа о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Посев выделенной культуры для определения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

2. Учет биохимических свойств культуры (токсигенной и нетоксигенной), выделенной во второй день исследования через 24 часа роста первичного посева.

Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта и дополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенных коринебактерий дифтерии, выделенных ранее.

Пятый день (96 часов)

Выдача бактериологического ответа о выделении через 48 часов роста первичного посева токсигенных и нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта.

 

Методики идентификации коринебактерий

 

1. Методика определения токсигенных свойств

 

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (in vitro) лежит взаимодействие между токсином и антитоксином, которое происходит в плотных питательных средах в местах оптимальных количественных соотношений токсина, продуцируемого коринебактериями дифтерии, диффундирующего в агар, и антитоксина, содержащегося в антитоксической противодифтерийной сыворотке. В тех участках агара, где токсин встречается с антитоксином, выпадает преципитат в виде белых линий, "стрел" или "усов".

Следует строго следить за плотностью среды, установлением pH, режимом стерилизации, прозрачностью, точным соблюдением целого ряда технических условий постановки пробы.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные и смесь колоний или со скошенного агарового косяка). Культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии в этих случаях преципитатов в агаровом челе опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном диаметром 10 см; питательную среду - агар на бульоне Мартена или сухую среду НИ питательных сред МЗ СССР (г. Махачкала) - ОТДМ; стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 1,5 х 8,0 см; нормальную лошадиную сыворотку или сыворотку крупного рогатого скота; противодифтерийную антитоксическую сыворотку или ферментированный и очищенный специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (однозональная сыворотка); контрольный токсигенный штамм коринебактерий дифтерии 24 - 48-часового роста (пересевается в условиях лаборатории каждые сутки, чтобы осуществлять пробу).

Приготовление чашек для постановки пробы на токсигенность

При небольшом объеме работы питательный агар для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки). Питательный агар, разлитый во флаконы, требует многократного расплавления, а длительное термическое воздействие значительно ухудшает его качество. Питательный агар расплавляют в водяной бане при 90°, тотчас же вынимают из бани, остужают до 50° и добавляют 20% сыворотки крови лошади (1,5-процентный агар) или 30% сыворотки крови крупного рогатого скота (1,8-процентный агар). Так, к питательному агару, разлитому по 10 мл в пробирки, добавляют 2 мл сыворотки лошади или 3 мл сыворотки крупного рогатого скота, обжигают края пробирки и выливают (соблюдая правила асептики) в стерильную чашку Петри, равномерно распределяя по дну чашки осторожным покачиванием, не вспенивая среды. На середину поверхности застывшего агара обожженным пинцетом накладывают фильтровальную бумажку, предварительно смоченную антитоксической противодифтерийной сывороткой или ферментированным и очищенным специфической сорбцией дифтерийным антитоксином. Чашки подсушивают в термостате при 37° в течение 15 - 20 мин., повернув вверх дном чашку и крышку.

Чашки со средой для определения токсигенности без фильтровальной бумажки можно хранить в условиях холодильника одни сутки.

Приготовление бумажных полосок

Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером 1,5 х 8,0 см, заворачивают по 2 - 4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 30 мин. Сохраняют пакетики с бумажными полосками в стерильной чашке Петри до 3 недель.

Смачивание фильтровальных бумажек производят в стерильной чашке Петри, для этого их переносят из пакетика обожженным пинцетом и смачивают 0,25 мл противодифтерийной антитоксической сыворотки или очищенным специфической сорбцией дифтерийным антитоксином, содержащим 500 МЕ в 1 мл. Чтобы не было излишков сыворотки на бумажке при переносе на агар обожженным пинцетом, ее слегка встряхивают или прикладывают к стерильной крышке чашки Петри.

Разведение противодифтерийной антитоксической сыворотки

Противодифтерийную антитоксическую сыворотку или ферментированный и очищенный специфической сорбцией дифтерийный антитоксин переливают из ампул в стерильную пробирку, соблюдая все правила обращения со стерильными препаратами. На пробирку наносят все данные этикетки с указанием срока хранения. Хранят сыворотку в условиях холодильника.

Сыворотки должны быть разведены стерильным физиологическим раствором до содержания 500 МЕ в мл. Коммерческий препарат - противодифтерийная антитоксическая сыворотка может содержать разное количество МЕ в ампуле (500 МЕ, 10000 МЕ, 20000 МЕ и др.) и в разных объемах.

Примеры разведения сыворотки

1. Ампула противодифтерийной антитоксической сыворотки содержит 1000 МЕ в объеме 4,8 мл (это указано на коробке, в которую вложены ампулы с сывороткой). В данном случае можно принять общий объем сыворотки за 5,0 мл. Следовательно, в 1,0 мл сыворотки содержится 1000 МЕ : 5 = 2000 МЕ. Чтобы получить 500 МЕ в мл, следует каждый мл развести в 4 раза, т.е. 1 мл сыворотки + 3 мл стерильного физиологического раствора. В зависимости от необходимости сыворотку можно развести в меньших объемах. Например: 0,1 мл сыворотки + 0,3 мл физиологического раствора; 0,2 мл сыворотки + 0,6 мл физиологического раствора; 0,3 мл сыворотки + 0,9 мл физиологического раствора и т.д.

2. Разведение сыворотки можно сделать другим способом. Если ампула содержит 5000 МЕ в 2,5 мл, следовательно, 500 МЕ содержится в 0,25 мл. К этому объему добавляют 0,75 мл стерильного физиологического раствора и тогда 500 МЕ будет содержаться в 1,0 мл. Если ампула содержит 10000 МЕ (20000 МЕ) в 5 мл (10 мл), то 5000 МЕ будет содержаться в 2,5 мл как в первом, так и во втором случаях. Таким образом, из ампулы берут 0,25 мл сыворотки, добавляют 0,75 мл стерильного физиологического раствора, в результате 1,0 мл сыворотки будет содержать 500 МЕ. На смачивание полоски из фильтровальной бумаги требуется 0,25 мл сыворотки (100 - 125 МЕ). Разведенную противодифтерийную антитоксическую сыворотку можно хранить в условиях холодильника до 7 дней.

Ферментированный и очищенный специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (однозональная сыворотка) разведения не требует, т.к. в каждом мл препарата содержится 450 МЕ - 500 МЕ.

Нормальные сыворотки животных

При приготовлении питательной среды для определения токсигенности используют нормальные сыворотки лошади или крупного рогатого скота. Сыворотки непригодны при наличии мути, большого гемолиза (красного, бурого цвета), обозначения "для технических целей". Такие сыворотки можно использовать для приготовления скошенного сывороточного агара или транспортной среды. Рекомендуется осуществлять предварительный контроль всех вновь поступающих в лаборатории серий сыворотки лошади или крупного рогатого скота с токсигенным контрольным штаммом на проверенной среде на токсигенность и контроль на отсутствие противодифтерийных антитоксических антител в сыворотках лошади в РПГА с коммерческим дифтерийным антигенным диагностикумом (см. Инструкцию к препарату).

Засев пробы

Культуру засевают в виде "бляшки" диаметром 0,7 - 0,8 см с расстояния 0,7 - 0,8 см между "бляшками" и на расстоянии 0,5 см от края полости фильтровальной бумаги.

При исследовании на токсигенность 1/2 колонии и смеси 2 - 6 колоний посев производят двумя "бляшками" по обе стороны фильтровальной бумаги. Половина колонии (отдельной изолированной или по половине от двух колоний) помещают на одной стороне чашки, а с другой - смеси колоний. На одну чашку следует помещать не более 10 "бляшек", при этом 6 "бляшек" испытуемой культуры, 4 - контрольного штамма (см. схему).

Контролем служит токсигенный штамм 24 - 48-часового роста. Чашки с посевом помещают в термостат при 37°.

Учет результатов

Результат учитывают через 18 - 24 часа и 48 часов роста.

При использовании антитоксической противодифтерийной сыворотки следует учитывать, что появление преципитатов в агаровом геле у коринебактерий возможно не только за счет взаимодействия токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и за счет взаимодействия бактериальных антител с соответствующими антигенами микробной клетки (неспецифические преципитаты по токсину). Это зависит от того, что изготовляемые сыворотки не являются моновалентными препаратами, кроме ферментированного и очищенного специфической сорбцией дифтерийного антитоксина. Помимо антител к дифтерийному экзотоксину, в них содержатся в различных количественных соотношениях и антитела к бактериальному компоненту коринебактерий дифтерии.

Неспецифические преципитаты могут образовываться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Эти преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48 - 72 часа, но у некоторых штаммов - и на 1-е сутки.

Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма с линиями контрольного (токсигенного штамма). В тех случаях, когда у контрольного штамма появляется несколько линий преципитации, специфическими следует считать наиболее четкие и наиболее рано появляющиеся преципитаты. Наблюдаются следующие варианты в образовании преципитатов.

1. Испытуемые коринебактерии дифтерии, у которых образуются преципитаты, считаются токсигенными, если эти линии преципитации сливаются с соответствующими специфическими линиями токсигенного штамма или идут на смыкание с ними.

2. Испытуемые коринебактерии дифтерии считаются нетоксигенными:

а) если линии преципитации у испытуемой культуры отсутствуют при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;

б) если линии преципитации располагаются так, что концы их не могут слиться с концами специфических линий контрольного штамма, а идут наперекрест с ним (неидентичны);

в) линии преципитации испытуемого штамма сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;

г) линии преципитации испытуемого штамма перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.

Иногда отмечается появление множественных неспецифических линий преципитации.

Хранение штаммов в условиях лаборатории

1. Штаммы, в том числе и контрольный, культивируют в условиях лаборатории на 10-процентном сывороточном агаре.

2. Хранить штаммы, в том числе и контрольный, можно:

а) на 10-процентном сывороточном агаре в условиях холодильника (пересев каждые 14 дней);

б) 0,1-процентном полужидком агаре, приготовленном на мартеновском бульоне (pH - 7,6) при комнатной температуре (пересев один раз в 2 - 3 месяца). Полужидкий агар разливают по 8 мл в пробирки - 0,5 мл или 1,0 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота.

Контрольный штамм получают в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, НИИВСах, НИИЭМах, в лабораториях городских и областных СЭС. Нельзя использовать производственный штамм PW-8 и его варианты. Контрольный штамм необходимо периодически засевать на кровяной агар (берут 1 пробирку с агаром для определения токсигенности + 10% крови).

 

2. Определение фермента цистиназы

 

Коринебактерии дифтерии и некоторые коринебактерии ульцеранс обладают ферментом - цистиназой, ложнодифтерийные бактерии и другие дифтероиды этого фермента не имеют.

В среду, разлитую в узкие пробирки столбиком не менее 3-х см (лучше 4 см), засевают культуру уколом. При росте коринебактерий дифтерии благодаря ферменту цистиназе расщепляют находящийся в среде цистин, а образующийся при этом сероводород вступает в реакцию с уксуснокислым свинцом, находящимся в среде, последний переходит в сернокислый свинец - соединение темно-коричневого цвета. Гипосульфит натрия, входящий в состав модифицированной среды, ускоряет образование и индикацию цистиназы. При посеве уколом коринебактерии дифтерии вызывают не только почернение среды по ходу посева (укола), но и образуют вокруг него облачко темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности.

Результаты учитывают через 24 часа. Для получения предварительного ответа (через 3 часа) необходимо в среду внести много культуры (5 - 6 колоний). Рекомендуется одновременно ставить контроль среды - в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм.

 

3. Определение фермента уреазы

 

Ложнодифтерийные бактерии, коринебактерии ульцеранс и часть дифтероидов имеют фермент уреазу, который способен расщеплять мочевину с образованием аммиака и углекислоты. Коринебактерии дифтерии этим ферментом не обладают.

Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах: путем посева на бульон с мочевиной и по методу Заксе:

а) в бульон с мочевиной, разлитый в пробирки по 2 - 3 мл, засевают чистую культуру коринебактерий дифтерии и ставят в термостат. Результаты учитывают через 18 - 24 часа;

б) для определения уреазы по методу Заксе ex tempore смешивают реактив А (1 часть) и реактив В (19 частей). Смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл и вносят испытуемые культуры в количестве нескольких петель. Нельзя брать конденсационную воду, т.к. она имеет щелочную реакцию и может изменить pH среды, а следовательно, и цвет индикатора. Пробирки помещают в термостат при 37° на 30 минут.

Фермент уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака и углекислоты, изменяет pH среды и происходит ее покраснение. При отсутствии фермента уреазы изменения цвета среды не происходит. Рекомендуется одновременно ставить контроль среды - в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный дифтерийный штамм.

 

4. Определение сахаролитических ферментов

 

Для определения сахаролитической активности коринебактерий дифтерии используют среды с углеводами (сахароза, глюкоза) и растворимый крахмал.

Культуру вносят в каждую пробирку со средой, обожженной на огне петлей. Результаты учитывают через 24 часа, а при отрицательном крахмальном признаке - через 48 часов пребывания посевов в термостате.

При сбраживании того или иного углевода, т.е. при кислотообразовании, наблюдается восстановление обесцвеченного фуксина, и среда приобретает малиновый цвет. Рекомендуется одновременно ставить пробы с контрольным дифтерийным токсигенным штаммом варианта гравис.

 

5. Восстановление нитратов в нитриты

 

Способность коринебактерий дифтерии восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) является дополнительным признаком, позволяющим дифференцировать коринебактерии ульцеранс.

Если нитрат восстановлен в нитрит, то при добавлении соответствующего реактива к засеянному нитратному бульону появляется красное окрашивание. Этот метод рекомендуется для головных бактериологических лабораторий, где возможно собирать и регистрировать распространение штаммов коринебактерий ульцеранс.

 

6. Серологическая идентификация и определение

серологического варианта

 

При серологическом изучении токсигенных коринебактерий дифтерии пользуются классификацией, утвержденной 30.12.1960 МЗ СССР. Согласно этой классификации коринебактерии дифтерии подразделяют на 7 основных (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) и 4 дополнительных (8, 9, 10, 11) серологических вариантов, обозначенных арабскими цифрами.

Агглютинирующие сыворотки выпускают неадсорбированные сухие к каждому серологическому варианту и к смеси серологических вариантов (поливариантная). Перед употреблением сухую сыворотку следует растворить в стерильной дистиллированной воде из расчета 1 мл на 1 ампулу. Сухая сыворотка должна растворяться при комнатной температуре в течение 2 - 3 минут. Титр растворенной сыворотки соответствует титру, указанному на этикетке.

В случае если растворенная сыворотка не может быть сразу использована, она должна быть перелита из ампулы в пробирку с ватной пробкой, с соблюдением всех правил обращения со стерильными препаратами. В таком виде сыворотка может сохраняться при температуре 6 +/- 2° в холодильнике до 2-х недель.

Поливариантная дифтерийная агглютинирующая сыворотка применяется для дифференциации коринебактерий дифтерии от других представителей рода коринебактерий в реакции агглютинации на стекле. Сыворотку разводят до рабочего разведения 1:10 3-процентным солевым раствором (см. рецепт приготовления).

Для реакции агглютинации на стекле используют суточную чистую культуру коринебактерий дифтерии, выросшую на 10-процентном сывороточном агаре. Сначала ставят контроль в капле 3-процентного солевого раствора, спонтанно агглютинирующиеся культуры дальше не изучают. Культуру тщательно растирают петлей на предметном стекле и постепенно смешивают с каплей сыворотки. В случае некоторой негомогенности культуры рекомендуется для постановки реакции агглютинации на стекле использовать густой смыв ее, профильтрованный через вату, накрученную на кончик пастеровской пипетки.

Положительная реакция характеризуется появлением агглютината (2 - 3 минуты). При оценке интенсивности агглютинации лучше пользоваться вогнутым зеркалом.

При необходимости определения серологического варианта можно проводить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с вариантными сыворотками в разведении 1:25 - 1:50. Окончательно серологический вариант определяют в линейной реакции агглютинации объемным или капельным методом.

При постановке линейной реакции агглютинации сыворотку последовательно двукратно разводят 3-процентным солевым раствором в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:100 и до титра, указанного на этикетке. В качестве антигена используют суточную культуру коринебактерий дифтерии, выращенную на 10-процентном сывороточном агаре. Взвесь культуры (1 млрд. микробных клеток в 1 мл в 3-процентном солевом растворе) набирают стерильной пипеткой через ватный фильтр (вата, накрученная на конце пипетки). При такой методике получают гомогенную взвесь культуры в 3-процентном солевом растворе. К разведенной сыворотке прибавляют по 0,5 мл бактериальной взвеси. Пробирки помещают в термостат при температуре 37° до следующего дня. Результат реакции учитывают невооруженным глазом по характеру выпавшего агглютината "зонтика" и степени просветления надосадочной жидкости без встряхивания. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, при которой плотный осадок "зонтиком" и полное просветление жидкости над ним. При отчетливом осадке "зонтиком" и слегка опалесцирующей жидкости реакцию оценивают на 3 плюса. Титром антител испытуемой сыворотки считают последнее разведение сыворотки, дающее агглютинацию на 3 плюса. Изучаемую культуру относят к тому серологическому варианту, с сывороткой которого отмечена положительная реакция в разведении не меньшем чем половина титра сыворотки, указанного на этикетке.

Контролями служат:

1. Наименьшее разведение сыворотки по 0,5 мл (2 пробирки), в которые не добавляют бактериальную взвесь.

2. 3-процентный солевой раствор без сыворотки по 0,5 мл (2 пробирки), в которые добавляют бактериальную взвесь (1 млрд. микробных клеток в мл) по 0,5 мл.

В контролях должна отсутствовать спонтанная агглютинация. В пробирках с бактериальной взвесью осадок должен быть в виде "бляшки" с ровными краями без просветления надосадочной жидкости.

Для установления серологического варианта изучаемой культуры реакцию агглютинации следует ставить сначала с сыворотками основных серологических вариантов, а затем при отрицательных результатах - с сыворотками дополнительных серологических вариантов.

Сухие агглютинирующие сыворотки можно хранить при комнатной температуре.

 

7. Методика индикации дифтерийного токсина

(в реакции нейтрализации антител (РНАт))

 

В целях раннего выявления дифтерийного токсина - для получения предварительного ответа - ставят реакцию нейтрализации антител.

РНАт основана на феномене пассивной гемагглютинации. Для ее постановки нужны все те же ингредиенты, которыми пользуются при обнаружении антител в сыворотке крови (см. "Инструкцию" к коммерческим эритроцитарным дифтерийным диагностикумам для РПГА).

РНАт в отличие от РПГА 3-компонентна. В ней исследуют ряд двукратных разведений токсина (или анатоксина) - возбудителя дифтерии, взаимодействующих с двумя гемагглютинирующими единицами (ГЕ) стандартных противодифтерийной антитоксической сыворотки.

В результате соединения токсина с антисывороткой образуются серологически инертные комплексы (АГ + АТ), не склеивающие эритроциты дифтерийного антигенного эритроцитарного диагностикума (ДАгЭД). По мере уменьшения содержания токсина в ряду разведений от большего к меньшему перестают образовываться комплексы (АГ + АТ) и оставшиеся свободными антитела агглютинируют ДАгЭД.

Если в РПГА в низких разведениях испытуемых или стандартной сывороток наблюдается агглютинация эритроцитов с постепенным уменьшением ее интенсивности - от "+" к "-", в РНАт положительный результат заключается в предотвращении агглютинации, т.е. от "-" к "+". В РПГА чем выше титр сыворотки, тем длиннее ряд агглютинации (плюс эффект), в РНАт чем больше токсина в испытуемом материале, тем длиннее ряд без агглютинации (минус эффект).

Объекты исследования в РНАт:

1. Чистые или смешанные культуры на дифференциально-диагностических средах (колонии на чашке первичного посева или сывороточно-агаровом косяке).

2. Материал на тампонах из зева и носа в транспортной среде (лучше бульоне).

3. Экстракты органов (постмортальные исследования).

4. Токсин (анатоксин) возбудителя дифтерии при изучении интенсивности токсинообразования у коринебактерий дифтерии в лабораторных условиях, в контроле динамики токсинообразования в производстве.

Если имеется материал из зева и носа на тампонах, засеянный в транспортную среду (лучше в жидкий рыбный бульон), то через 20 - 24 часа подращивания в термостате при 37° после засева материала на плотную питательную среду (см. методику посева материала из транспортной среды) можно также поставить РНАт для выдачи предварительного ответа по токсину. В случае засева материала из зева и носа сразу на плотные питательные среды при бактериологическом исследовании постановку РНАт можно осуществить через 24 часа при наличии роста подозрительных колоний на чашках первичного посева или с агарового косяка, если предварительно исследуемая культура была посеяна на косяк (т.е. РНАт ставят одновременно с пробой на токсигенность в плотной питательной среде). В последнем случае исследуемый материал (1 - 3 колонии с плотной питательной среды с чашек Петри первичного посева или одна петля с косяка) засевают в пробирки с рыбным бульоном (см. пропись транспортной среды) и инкубируют в термостате при 37° 24 часа (если позволяют условия, то достаточно подращивания 6 часов). Из пробирок с жидкой средой берут часть материала (приблизительно 0,5 мл), добавляют 0,05 мл (1 каплю) цельного формалина, встряхивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Оставшийся материал продолжают инкубировать при 37° в течение 24 часов для повторного испытания в РНАт, чтобы повысить эффективность обнаружения токсина коринебактерий дифтерии.

Непосредственно перед постановкой РНАт (или накануне) в РПГА определяют активность эритроцитарного диагностикума (ДАгЭД) со стандартной противодифтерийной антитоксической сывороткой (СПС). Методика постановки и учета РПГА описаны в "Инструкциях", приложенных к коммерческим ДАгЭД. Предельное разведение СПС, в котором еще регистрируется полноценная гемагглютинация, называют 1 гемагглютинирующей единицей (1 ГЕ) антител, 2 ГЕ - это разведение, предшествующее 1 ГЕ. Например, предельное разведение СПС (титрование начато с 1 МЕ в мл, двукратное), в котором регистрируется полноценная гемагглютинация с коммерческим ДАгЭД, равно титру 1:512, тогда 2 ГЕ будут содержаться, если СПС (1 МЕ в мл) развести 1:256. Это будет рабочее разведение СПС.

На все контроли потребуется приблизительно 0,5 мл рабочего разведения СПС, на каждый испытуемый ряд (пробу) - 0,2 мл (микрометод). Таким образом, для изучения одной пробы потребуется 0,7 мл рабочего раствора СПС, а для изучения, например, 10 проб - 2,5 мл СПС.

Следовательно, чтобы приготовить рабочий раствор СПС, содержащий 2 ГЕ (т.е. разведение 1:256) в объеме не менее 2,5 мл для 10 проб, необходимо взять СПС, содержащую 1 МЕ в мл, большой петлей микротитратора (0,05 мл) и внести в 12,75 мл раствора для постановки РПГА (1-процентная нормальная кроличья сыворотка). Оставшаяся после постановки РНАт разведенная (1:256) сыворотка (СПС) не хранится.

Техника постановки РНАт

При макрометоде используют полистироловые пластины или пробирки, мерные стеклянные пипетки или шприцы-дозаторы. При микрометоде пользуются полистироловыми пластинами Такачи или отечественными (Москва, Ленинград) с лунками (8 х 12) объемом 0,2 мл, капельницами с дозированным объемом (0,025 мл и 0,05 мл), пластиковыми разовыми или стеклянными (Такачи) с насадкой, а также термостойкими петлями для титрования (Такачи).

В лунки полистироловой пластинки или пробирки наливают по 0,2 мл раствора для реакции (макрометод) или 0,025 мл раствора (микрометод). В первую лунку добавляют 0,2 мл (0,025 мл) испытуемого источника дифтерийного антигена (токсина, анатоксина). Пипеткой или шприцом-дозатором (макрометод) или петлей от микротитратора Такачи (0,025 мл) осуществляют взятие и перенос из каждой лунки в последующую по 0,2 мл (0,025 мл) смеси антигена с раствором. Таким образом, получается ряд двукратных разведений с объемом каждого по 0,2 мл (макрометод) или 0,025 мл (микрометод).

Предварительно установленная активность стандартной сыворотки с данной серией дифтерийного диагностикума служит основанием для выбора рабочей дозы. Она равна 2 ГЕ в объеме 0,2 мл (макрометод) или 0,025 мл (микрометод), которую приливают в каждую лунку с раститрованным источником испытуемого антигена. Так же титруют контрольный токсигенный штамм и добавляют в каждую лунку 2 ГЕ стандартной сыворотки. Смеси инкубируют при 37° 30 мин., затем в каждую лунку добавляют ДАгЭД по 0,05 мл (макрометод) или 0,025 мл (микрометод), учет результатов производят по тем же критериям и в те же сроки, что и для РПГА.

 

Обязательные контроли РНАт

 

Контроли с положительным результатом

1. На отсутствие спонтанной агглютинации опытного и контрольного диагностикумов в растворе для реакции (см. "Инструкцию" по применению коммерческих диагностикумов дифтерийных эритроцитарных для РПГА).

2. На отсутствие гетерогемагглютининов к бараньим эритроцитам в исследуемом материале. Может быть поставлен как с контрольными эритроцитами, так и с опытными.

3. На отсутствие гетерогемагглютининов к бараньим эритроцитам и спонтанной агглютинации опытного диагностикума в жидкой среде подращивания без любого материала.

Контроли с положительным результатом

1. На подтверждение количества 2 гемагглютинирующих единиц антител в рабочем разведении стандартом сыворотки, примененной в РНАт. Этот же контроль служит подтверждением специфической активности опытного диагностикума (ДАгЭД) относительно стандартной сыворотки.

Рабочий раствор стандартной сыворотки, где определено 2 ГЕ, титруется в 3 - 4 пробирках или лунках: 0,4 мл; 0,3 мл; 0,2 мл; 0,1 мл (макрометод).

Последние три лунки доводят до равного объема с первой (0,4 мл) раствором для реакции, т.е. в 4-ую лунку добавляют 0,3 мл раствора, в 3-ю - 0,2 мл, во 2-ю - 0,1 мл. В каждую из лунок прибавляют 0,05 мл 3-процентной концентрации ДАгЭД.

При микрометоде только в первую и вторую лунки помещают по 0,025 мл рабочего раствора стандартной сыворотки, во вторую, третью и четвертую лунки вносят по 0,025 мл раствора для реакции: из 2-й лунки в 3-ю термостойкой петлей переносят по 0,025 мл, так же из 3-й лунки в 4-ую. Из 4-й лунки 0,025 мл выливают. Во все 4 лунки закапывают по 0,025 мл 0,3-процентной концентрации ДАгЭД.

При таком контролировании в первой лунке положительная реакция учитывается для 2-х ГЕ, во второй - для 1 ГЕ, а в 3-ей - для 0,5 ГЕ РНАт может быть учтена, если в рабочем растворе стандартной сыворотки подтверждено присутствие 2 ГЕ антител, т.е. гемагглютинация должна регистрироваться в 1-й и во 2-й пробирках (лунках).

2. Контрольный токсигенный штамм подращивают в жидкой среде (лучше 20 - 24 часа). Его токсин должен нейтрализовать 2 ГЕ антител СПС в разведении не менее 1:8. В противном случае следует определить причины низкой активности токсинообразования у контрольного токсигенного штамма (качество среды подращивания, срок культивирования, соблюдение температурного режима, качество ингредиентов реакции и соблюдения условий ее подстановки).

Интерпретация результатов применения РНАт для выявления дифтерийного токсина

В случае выявления дифтерийного токсина, когда РНАт в испытуемом материале имеет минус эффект даже в разведении 1:2 - 1:4 (при всех отрицательных контролях) выдается предварительный ответ о нахождении токсина возбудителя дифтерии, окончательный ответ выдают, когда выделен возбудитель дифтерии и определены его токсигенные свойства при бактериологическом исследовании. При невыявлении дифтерийного токсина в РНАт предварительный и окончательные ответы выдают по общепринятой методике (см. методику бактериологического исследования на дифтерию).

Питательные среды

Качество питательной среды является важнейшим условием при любом бактериологическом исследовании. Чтобы добиться максимальной всхожести и высеваемости коринебактерий дифтерии из исследуемого материала, необходимо создать оптимальные условия для роста и размножения этих бактерий, сохранение их биологических свойств и условий для ингибиции сопутствующей флоры.

В настоящее время в качестве основы для питательных сред используют сухие коммерческие питательные агары. Лучшим для высеваемости коринебактерий дифтерии является сухой питательный агар "Д" (дрожжевой), несколько хуже - сухой питательный агар "КД" (кормовые дрожжи), можно использовать сухие питательные агары, предназначенные для выращивания других микроорганизмов, например, эритритагар. Питательные агары готовят по прописи на этикетке и ex tempore добавляют кровь, теллурит калия по прописи приготовления кровяных теллуритовых сред, которые являются элективными, дифференциально-диагностическими средами для выделения коринебактерий дифтерии, так как содержат до 10 - 15% крови и теллурит калия - лучший ингибитор роста другой микрофлоры. Если при контроле на всхожесть титрованным количеством коринебактерий дифтерии среды не будут удовлетворять требованиям контроля, то питательные агаровые основы нужно готовить на бульонах (коммерческий сухой рыбный бульон; перевар Хоттингера, 1-процентная пептонная вода, приготовляемые в лабораториях с содержанием аминного азота 150 - 180 мг %). До 1985 года отечественной промышленностью изготавливался для нужд лечебной медицины аминопептид, представлявший собой ферментативный гидролизат крови животных и содержавший полноценный набор аминокислот и простейших пептидов. Аминопептид выпускался в стерильном виде в стеклянных флаконах по 450 мл. Препарат изготавливался в соответствии с требованиями фармакопейной статьи (ФС 42-630-72), что обеспечивало его высокую стандартность. Целесообразно использовать такой аминопептид (с истекшим сроком годности), а также "Аминопептид для микробиологических питательных сред", выпуск которого планируется на 1986 год, для приготовления кровяных теллуритовых сред. Прописи приготовления питательной основы на аминопептиде для кровяной теллуритовой среды, для среды Клауберг П и прописи приготовления этих сред приведены в данной Инструкции.

Промышленность выпускает сухую Хинозольную дифференциально-диагностическую среду Бучина для выделения коринебактерий дифтерии, которая готовится по прописи на этикетке с добавлением 5% крови.

При бактериологическом исследовании материалов на дифтерию наибольшей диагностической эффективностью при выявлении возбудителя дифтерии обладают кровяно-теллуритовые среды: Клауберг П и кровяно-теллуритовый агар. Эти среды следует использовать при обследовании всех категорий населения и особенно при массовых обследованиях по эпидпоказаниям. Среда Бучина уступает кровяно-теллуритовым средам в ингибирующей активности, кроме того, сроки формирования колоний коринебактерий дифтерии на разных сериях сред могут запаздывать на сутки в сравнении с кровяно-теллуритовыми средами.

Промышленность выпускает сухую среду для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии (ОТДМ), кроме этой среды в данной Инструкции приводится пропись приготовления мартеновского агара для определения токсигенных свойств и фермента цистиназы, а также модифицированная среда для определения фермента цистиназы на сухом питательном агаре (лучше агаре "Д"), прописи приготовления сред для определения сахаролитических свойств.

В качестве среды для отсева колоний и культивирования коринебактерий дифтерии пользуются сывороточной агаровой средой. Применение свернутой сыворотки нецелесообразно.

Методы приготовления питательных сред

Транспортная среда

В качестве питательной основы используют 0,1-процентный агар на переваре Хоттингера или 0,1-процентный агар на рыбном бульоне (из сухого коммерческого препарата). Можно использовать сухие питательные коммерческие агары. В последнем случае варят среду из расчета 0,2 или 0,3 г сухого питательного агара (в зависимости от прописи на этикетке) на 100 мл перевара Хоттингера или рыбного бульона. Содержание аминного азота - 150 - 180 мг % и pH - 7,6.

Полужидкую среду разливают в пробирки по 5,0 мл, стерилизуют в автоклаве при 120° (1 атм.) в течение 20 мин. или при 110° (0,5 атм.) - 30 мин. Срок годности - до 1 месяца при 4° (в холодильнике) или в течение 10 дней при комнатной температуре. Перед употреблением в каждую пробирку с соблюдением правил асептики добавляют 0,5 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота. Затем в каждую пробирку закапывают по 0,05 мл (1 капля) 2-процентного раствора теллурита калия. Среду выборочно контролируют на стерильность в термостате при 37° в течение 48 часов. Срок годности среды - 10 дней при условии хранения в холодильнике и 3 дня - при комнатной температуре.

Для постановки РНАт с целью индикации дифтерийного токсина материал из зева и носа или выросшую культуру лучше засевать в бульоны (Хонттингера, Мартена, рыбный). Рыбный бульон готовят из сухого коммерческого препарата по прописи на этикетке. Бульон разливают в пробирки по 3,0 мл. Стерилизуют в автоклаве при 120° (1 атм.) в течение 20 мин. или при 110° (0,5 атм.) - 30 мин. Содержание аминного азота - 150 - 180 мг %, строго следят за pH = 7,6. Срок годности - до 1 месяца при 4° (в холодильнике) или в течение 10 дней при комнатной температуре.

Перед употреблением в каждую пробирку с соблюдением правил асептики добавляют 1,0 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота. Затем в каждую пробирку закапывают 0,05 мл (1 капля) 2-процентного раствора теллурита калия. Среду на бульоне контролируют и хранят так же как и 0,1-процентную агаровую среду.

Среды для первичного посева исследуемого материала

1. Среда Клауберга П

К 100 мл 3-процентного питательного агара pH = 7,6 (от 5,2 г до 7,5 г сухого питательного агара - рассчитать в зависимости от прописи на этикетке - на 100 мл различных бульонов или дистиллированной воды), расплавленного и охлажденного до 50°, добавляют 3 мл 2-процентного раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл "лаковой" крови.

Приготовление глицериновой смеси

К 40 мл дефибринированной крови (или разбитых в физиологическом растворе сгустков, эритроцитарной массы) добавить 20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуется при температуре 110° в течение 30 мин.). Если используемая кровь, сгустки или эритроцитарная масса были нестерильны, то кровяную глицериновую смесь необходимо выдержать в холодильнике при температуре от 4 до 10° в течение 3 недель. Сохраняют в условиях холодильника до 4-х месяцев.

Приготовление "лаковой" крови

К 34 мл стерильной дистиллированной воды добавить 16 мл дефибринированной крови (или разбитых в физиологическом растворе сгустков).

 

Состав агаровой основы на аминопептиде

для среды Клауберга П (расчет на 1 литр)

 

1. Аминопептид - 0,35 л.

2. Дистиллированная вода - 0,65 л.

3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 5,0 г.

4. Натрий хлористый - 4,0 г.

5. Агар-агар - 30,0 г.

6. Л-цистин солянокислый - 0,01 г (1-процентный раствор - 1 мл).

7. Активированный уголь - 3,0 г.

На этой питательной основе среда Клауберга П готовится по выше указанной прописи.

2. Кровяной теллуритовый агар

К 100 мл 2-процентного питательного агара pH 7,6 (3,5 или 5 г сухого питательного агара (см. пропись на этикетке) на 100 мл различных бульонов или дистиллированной воды), расплавленного и охлажденного до 50°, добавляют 2 мл 2-процентного раствора теллурита калия и 10 - 15 мл гемолизированной крови (или кровяной смеси).

Приготовление гемолизированной крови

На каждые 10 мл дефибринированной крови добавить 2 мл стерильной дистиллированной воды.

Возможно использование кровяной теллуритовой смеси, составленной из гемоглобина сгустков крови или эритроцитарной массы с добавлением дистиллированной воды (или физраствора или сыворотки крупного рогатого скота) и теллурита калия (см. методику приготовления крови). На 100 мл питательного агара берут 12 мл (можно 11 - 16 мл) кровяной теллуритовой смеси и добавляют 1 мл 2-процентного раствора теллурита калия.

 

Состав агаровой основы для кровяной теллуритовой среды

(расчет на 1 литр)

 

1. Аминопептид - 0,25 л.

2. Дистиллированная вода - 0,75 л.

3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 5,0 г.

4. Натрий хлористый - 4,0 г.

5. Агар-агар - 20,0 г.

6. Л-цистин солянокислый - 0,01 г (1-процентный раствор 1 мл).

7. Активированный уголь - 3,0 г.

На этой питательной основе кровяная теллуритовая среда готовится так же, но добавляется кровь дефибринированная гемолизированная или кровяная смесь в количестве 5 мл.

Приготовление питательных агаровых основ на аминопептиде для среды Клауберга П и кровяной теллуритовой среды

Аминопептид разводят дистиллированной водой, добавляют натрий хлористый (NaCl) и агар-агар, кипятят до расплавления. Добавляют ЭКД, размешивают до его полного растворения, устанавливают pH = 7,7 - 7,8 20-процентным раствором едкого натра (NaOH) и кипятят 5 минут. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой, добавляют необходимое количество 1-процентного раствора Л-цистина. В случае отсутствия солянокислого цистина, хорошо растворимого в воде, можно использовать Л-цистин, растворимый в 0,1 N растворе едкого натра. Обязательным условием является полное растворение цистина. После Л-цистина добавляют уголь активированный из расчета 3,0 на 1 литр.

Питательные агаровые основы разливают в стерильные флаконы и стерилизуют при 110 - 112° (0,5 атм.) в течение 30 мин. с предварительным прогревом текучим паром при 100° в течение 3 мин. Сохраняются питательные агаровые основы в холодильнике в течение 2-х месяцев.

Сухая хинозольная индикаторная среда Бучина

К 100 мл дистиллированной воды или различных бульонов добавляют 7 - 8 г (согласно прописи на этикетке) порошка сухой хинозольной среды, тщательно размешивают и нагревают на слабом огне до полного растворения агара. Среду кипятят в течение 2 - 3 мин., не допуская пригорания агара до образования крупнопузырчатой, быстрооседающей пены. К охлажденной до 50° среде добавляют 5 мл стерильной дефибринированной крови. Не допускается применение среды без крови, с сывороткой.

Все питательные среды разливают по чашкам Петри слоем 3 - 4 мм. Они могут быть использованы в течение 3 суток при условии хранения при температуре от 4 до 10°.

Среда для отсева колоний и культивирования коринебактерий дифтерии - сывороточный агар

Сывороточный агар может быть приготовлен на любой питательной основе, применяемой для культивирования коринебактерий дифтерии.

К 100 мл расплавленного и охлажденного до 50° питательного агара (pH 7,6) стерильно добавляют 10 мл лошадиной или бычьей сыворотки. После перемешивания среду разливают в стерильные пробирки по 3 - 4 мл, которые укладывают в наклонном положении для образования скоса. Каждая партия сывороточного агара проверяется на стерильность: несколько пробирок из этой партии помещают на сутки в термостат. В случае прорастания среды уничтожаются все пробирки с сывороточным агаром. Пробирки со скошенным сывороточным агаром хранятся в условиях холодильника не больше 2-х недель.

Среды для определения токсигенности

1. Приготовление мартеновского агара с мясной водой двойной концентрации

Приготовление мартеновского пептона

Свиные желудки, желательно парные, с упругими стенками, большим количеством слизи и без катаральных явлений очищают от жира (желудки, пропитанные желчью, отбрасывают), разрезают и измельчают в мясорубке. Полученный фарш из желудков помещают в бутылки емкостью 3 - 5 литров и заливают подогретой до 40 - 50° водопроводной водой из расчета на 1 литр воды 300 - 500 г измельченной массы. Температура должна быть 40°. Туда же прибавляют 1% химически чистой соляной кислоты (уд. вес 1,19). Массу хорошо перемешивают и ставят в термостат: 1) либо на 15 - 18 часов (или более) при 37 - 40°; 2) либо при наличии отдельного термостата при 42 - 45° на 18 часов (или более). В течение процесса переваривания бутыль встряхивают, вначале чаще (через 1,0 - 1,5 час), затем реже. В хорошо переваренном пептоне на дне бутылки лежит небольшой слой мелкого темного осадка. Полноту осаждения балластных белков можно проверить путем добавления к 5 мл профильтрованного пептона 1 - 2 капли 10-процентного NaOH, муть не должна появляться.

Действие фермента останавливают нагреванием в водяной бане, постепенно доводя температуру до 80°, устанавливаемую по показанию термометра, погруженного в бутыль с препаратом. Нагревание продолжается в течение 10 мин. Для этой цели можно использовать аппарат Коха или автоклав. Бутыли тщательно взбалтывают, закрывают ватно-марлевой пробкой с бумажным колпачком и ставят в прохладное сухое помещение для отстаивания при температуре не выше 12°. Пептон годен к употреблению не ранее чем через 7 дней, когда плотно осядут взвешенные частицы.

Необходимо добавить 20 мл хлороформа на 1 л пептона для консервирования и закрыть бутыль резиновой пробкой. В таком виде может храниться без стерилизации при комнатной температуре.

Приготовление мясной воды

Для приготовления мясной воды двойной концентрации желательно пользоваться свежим незамороженным мясом средней упитанности нестарого животного. Обезжиренное, освобожденное от сухожилий мясо пропускают через мясорубку, заливают водой в пропорции 1 л воды на 1 кг фарша и оставляют на ночь в холодильнике (от 4 до 10°), утром смесь кипятят на асбестовой сетке в течение 15 - 20 минут с момента закипания. Готовый настой фильтруют, фарш отжимают, полученную мясную воду разливают в стерильные бутыли по 250 - 500 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут. Хранить по возможности в холодильнике.

Приготовление мартеновского агара

Мартеновский пептон - 0,5 л, мясная вода - 0,5 л, агар-агар - 15 - 18 г (1,5% - 1,8%), (1,5-процентный агар используют при добавлении 20% лошадиной сыворотки, 1,8-процентный - при добавлении 30% сыворотки крупного рогатого скота), уксуснокислый натрий - 5 г, мальтоза - 3 г.

15 или 18 г агара промывают в течение рабочего дня в проточной водопроводной воде, тщательно отжимают и переносят в 1 л мартеновского бульона (0,5 л мартеновского пептона и 0,5 мясной воды). Устанавливают pH 7,8 - 8,0 путем подщелачивания бульона 20-процентным раствором NaOH по бумажке с индикатором крезоловый красный, которая при этой реакции изменяет желтый цвет в розово-малиновый. Бульон кипятят в течение 10 мин., считая с момента закипания, затем добавляют 0,5% (5 г на 1 л) уксуснокислого натрия, 0,3 мальтозы (3 г на 1 л), проверяют pH и, если нужно, снова доводят до 7,8 - 8,0, кипятят в течение 15 минут, дают отстояться в теплом месте (в аппарате Коха, термостате) 2 - 3 часа и фильтруют через тканевый или ватно-марлевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70 - 80 мл) при большом объеме работы для одноразового использования или пробирки (10 мл) и стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 минут.

Приготовление бумажек с индикатором крезоловый красный

0,1 г крезолового красного растворяют в 100 мл 95-процентного спирта и оставляют при температуре 37° на 24 часа, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтрованной бумаги и быстро высушивают. Ярко-желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.

Сухой питательный агар для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии

Для приготовления среды сухой порошок растворяют в воде из расчета 3 г на 100 мл, тщательно размешивают на слабом огне при постоянном помешивании, нагревают до полного расплавления агара, кипятят в течение 5 - 7 минут с закрытой ватной пробкой, фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70 - 80 мл) при большом объеме работы для одноразового использования или пробирки (10 мл), стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 минут. Перед разливом в чашки Петри к расплавленной и охлажденной до 50° среде добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота.

Среды для определения биохимических свойств

1. Среда Пизу для определения фермента цистиназы на мартеновском агаре

    К  90  мл расплавленного 1,5-процентного только мартеновского агара (не

допускается  использование  агара  Хоттингера),  pH  7,6,  добавляют  2  мл

1-процентного раствора цистина, приготовленного  на  0,1 N  растворе  H SO

                                                                       2  4

(или N HCl),  тщательно  перемешивают  и  добавляют  такой  же  объем 0,1 N

раствора   NaOH.  Раствор   NaOH   добавляют  к  среде  для   нейтрализации

соответствующего количества кислоты. Растворы кислот и щелочей должны  быть

взаимно    оттитрованы,    можно   использовать   фиксаналы,    выпускаемые

предприятиями химической промышленности.

Среду стерилизуют при температуре 112° в течение 30 минут, можно сохранять один месяц в холодильнике.

Агар с цистином расплавляют при 90° (не кипятят) для сохранения цистина. К охлажденной до 40 - 45° среде добавляют 1 мл 10-процентного раствора уксуснокислого свинца и 9 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота с соблюдением правил асептики и разливают по пробиркам любого диаметра (лучше агглютинационным) столбиком высотой 3 - 4 см.

Необходимо учитывать, что при 50° сыворотка в присутствии уксуснокислого свинца свертывается, и среда приобретает молочный цвет, что затрудняет учет реакции.

Среда Пизу для определения фермента цистиназы (модификация Ю.М. Фельдмана)

В 90 мл дистиллированной воды растворить 3 г сухого питательного агара (лучше агара "Д" или эритритагара) и прокипятить. (Навеска сухого питательного агара рассчитывается исходя из прописи на этикетке, чтобы плотность его составляла 1,5%.) Добавить 2 мл 1-процентного раствора цистина в 0,1 N растворе соляной кислоты (HCl) с последующим подведением pH среды до 7,6, 2 мл 0,1 N раствора NaOH (как указано выше). Мутные или окрашенные серии агара не используют. Среда стерилизуется 10 - 15 мин. при 112°.

К расплавленной и охлажденной до 40 - 45° среде добавляют 1 мл 10-процентного раствора уксуснокислого свинца, 2 мл стерильного 10-процентного раствора гипосульфита натрия, приготовленного ex tempore на дистиллированной воде, 10 мл сыворотки лошади или крупного рогатого скота. Далее разливают, как в предыдущем рецепте.

Раствор 10-процентного уксуснокислого свинца и 10-процентного гипосульфита натрия готовят ex tempore, используя стерильные пробирки и дистиллированную воду, стерилизуют текучим паром или на водяной бане при 80 - 90° 30 мин.

2. Среды для определения фермента уреазы

Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах: путем посева на бульон с мочевиной и по методу Заксе.

Бульон с мочевиной для определения уреазы

К 100 мл стерильного мясо-пептонного или бульона Хоттингера (pH 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6-процентного спиртового раствора индикатора крезолрот. Разливают над огнем по 2 - 3 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром в течение 10 мин. Результаты учитывают через 20 - 24 часа после выдерживания в термостате при 37°.

Приготовление реактивов для определения уреазы по методу Заксе

Готовится 2 реактива: А и В.

Реактив А

Мочевина - 2 г.

96° этиловый спирт - 2 мл.

Дистиллированная вода - 4 мл.

Реактив В

0,2-процентный раствор фенолрот - 1 мл.

    Однозамещенный фосфат калия (KH PO ) - 0,1 г.

                                   2  4

    Двузамещенный фосфат калия (K HPO ) - 0,1 г.

                                 2   4

Хлористый натрий (NaCl) - 0,5 г.

Дистиллированная вода - 100 мл.

Реактив А не стерилизуют и хранят при температуре от +4° до + 10°. Реактив В стерилизуют в автоклаве текучим паром.

Для работы оба реактива смешиваются ex tempore из расчета 1 часть реактива А и 19 частей реактива В, смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл. Результат учитывают через 30 мин., после выдерживания в термостате при 37°.

Среды для изучения сахаролитических свойств

Для определения сахаролитической способности рекомендуется использовать среды на 1-процентной пептонной воде.

К 100 мл горячей дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 г химически чистой поверенной соли, после чего добавляют 1,0 мл индикатора Андреде. Устанавливают pH 7,4, кипятят 5 минут, фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой. К полученной основе добавляют один из перечисленных углеводов (сахароза, глюкоза) в количестве 0,5 г, крахмал (растворимый) - 0,5 г.

Среды разливают в пробирки по 2 - 3 мл и стерилизуют текучим паром в течение 3 дней по 30 минут или при 0,5 атм. 30 минут. Готовые среды с индикатором Андреде бесцветны или имеют слегка розоватый оттенок.

Приготовление индикатора Андреде

Посуда должна быть сухой, химически чистой, с притертой пробкой. На 100 мл дистиллированной воды добавляют:

0,5 г кислого фуксина;

16,4 мл 4-процентного раствора NaOH.

Раствор на сутки ставят в термостат при 37°, периодически встряхивают, 2-е суток выдерживают на свету и затем убирают в темное место. Свежеприготовленный раствор имеет соломенно-желтый цвет или слегка розовый оттенок, который исчезает в процессе хранения. Интенсивно розовый цвет индикатора указывает на необходимость увеличения щелочи в процессе приготовления до 1 мл.

Среда для восстановления нитрата в нитриты

    К  питательному бульону pH 7,3 - 7,5, свободному от нитритов (проверить

реактивом  Грисса), прибавляют  0,1% свободной от нитритов калийной селитры

(0,1 г KNO  на 100 мл питательного бульона), проверив еще раз на содержание

          3

нитритов,  разливают  по 5 мл в пробирки, предварительно тщательно промытые

проточной  водой.  Среды  стерилизуют  15 мин. при 120°. Пробирки со средой

засевают  изучаемой культурой и инкубируют в термостате при 37° в течение 5

дней. Для контроля инкубируют пробирку со средой, не засеянной культурой.

Приготовление реактива Грисса

Раствор N 1 - 0,8-процентная сульфаниловая кислота в 5 N уксусной кислоте. Раствор N 2 - 0,6-процентный диметил-альфа-нафталамин в 5 N уксусной кислоте.

Перед производством реакции смешивают равные объемы растворов N 1 и N 2, добавляют эту смесь по 3 капли в каждую пробирку с засеянным изучаемой культурой нитратным бульоном после 5 дней инкубации в термостате и 3 капли в контрольную пробирку.

Реактив годен в течение 15 мин., бесцветен, при появлении розового окрашивания непригоден. При редукции нитратов появляется красное окрашивание. Среда в контрольной пробирке цвета не изменяет.

Приготовление 3-процентного солевого раствора

    К  100  мл дистиллированной воды прибавляют 3 г NaCl и устанавливают pH

7,6 путем прибавления 3-процентного раствора Na HPO .

                                               2   4

Солевой раствор стерилизуют трехкратно текучим паром.

Методика бактериологического контроля питательных сред

В практических лабораториях каждая новая партия приготовленной питательной среды, особенно при использовании новых питательных основ (промышленного или лабораторного изготовления) или новых ингредиентов, входящих в состав среды, подлежит бактериологическому контролю ввиду возможной нестандартности основ и ингредиентов, используемых при изготовлении этих сред.

Бактериологическому контролю подлежат среды для первичного посева материала и среды для определения токсигенных, биохимических и сахаролитических свойств. При изготовлении сред важным моментом является предварительный контроль основы среды на содержание аминного азота.

1. Контроль качества сред Клауберг П, кровяно-теллуритового агара и среды Бучина устанавливают путем определения:

а) всхожести коринебактерий дифтерии;

б) ингибирующей активности в отношении сопутствующей флоры;

в) времени формирования колоний.

При этом используют контрольный токсигенный штамм или местные свежевыделенные токсигенные культуры коринебактерий дифтерии с типичными культурально-морфологическими свойствами. Оценка ингибирующей активности проводится с помощью штамма стафилококка (музейного или местного свежевыделенного).

Односуточную культуру дифтерии и стафилококка (18 - 20-часового роста), выращенную на сывороточно-агаровой среде, смывают физиологическим раствором и подводят под оптический стандарт мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, соответствующий 10 ед. мутности - условно 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл взвеси. Из исходной стандартной взвеси в стерильных пробирках готовят 10-кратные разведения путем последовательного переноса 0,5 мл физиологического раствора, тщательно перемешивая и меняя стерильную пипетку после каждого "шага".

 

СХЕМА ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КУЛЬТУРЫ

КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ И СТАФИЛОКОККА

 

┌────────┬───────────────────────┬───────────────────┬───────────────┐

│    N   │Кол-во физиологического│   Объем вносимой  │  Количество   │

│пробирок│    раствора (в мл)    │  культуры (в мл)  │микробов в 1 мл│

├────────┴───────────────────────┴───────────────────┴───────────────┤

│Исходное разведение - 1 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического │

│                       раствора (1000000000)                        │

├────────┬───────────────────────┬───────────────────┬───────────────┤

│1       │1,0                    │1,0 исходной взвеси│500000000      │

│2       │4,5                    │0,5 из 1-й пробирки│50000000       │

│3       │4,5                    │0,5 из 2-й пробирки│5000000        │

│4       │4,5                    │6,5 из 3-й пробирки│500000         │

│5       │4,5                    │0,5 из 4-й пробирки│50000          │

│6       │4,5                    │0,5 из 5-й пробирки│5000           │

│7       │2,0                    │0,5 из 6-й пробирки│1000           │

└────────┴───────────────────────┴───────────────────┴───────────────┘

 

Из двух последних разведений (6-го и 7-го) по 0,1 мл взвеси (соответственно 500 и 100 микр. кл.) вносят в 2 хорошо подсушенные чашки, досуха растирают шпателем (для каждой чашки новый шпатель). На 2 другие чашки с испытуемой средой производят таким же способом высев стафилококка. Учет результатов производят через 24 - 48 часов.

Среда признается годной к применению, если колонии коринебактерий дифтерии формируются на поверхности испытуемой среды через 24 часа (в среде Бучина - до 48 часов) инкубации в виде изолированных колоний. При посеве 100 высеянных микробных клеток - не менее 3 - 5 колоний при отсутствии роста стафилококка на всех засеянных чашках. При отсутствии роста коринебактерий дифтерии при посеве 500 и 100 м.к. опыт необходимо повторить. Если результат будет таким же, то среда не годится к употреблению.

2. Контроль среды для определения токсигенности коринебактерий дифтерии.

Данный контроль осуществляется путем приготовления среды для определения токсигенности и испытания ее контрольным дифтерийным штаммом, соблюдая все этапы методики определения токсигенных свойств на плотных питательных средах. Критериями оценки качества среды являются наличие преципитатов и время их образования. Пригодными для работы считаются те серии среды, при использовании которых у токсигенного контрольного штамма интенсивные преципитаты образуются через 24 часа после посева "бляшками". Среды (или новые ингредиенты) не могут быть использованы и подлежат замене в случае отсутствия преципитатов или появления их в более поздние сроки.

3. Бактериологический контроль сред для определения биохимических и сахаролитических свойств проводят путем определения степени выраженности и времени формирования данного признака. В среду Пизу, бульон с мочевиной (или реактивы А и В), в среды Гисса засевают петлей контрольный дифтерийный штамм; при проверке сред Гисса контрольный дифтерийный штамм должен быть биохимического типа гравис.

Методика количественного определения аминного азота <*>

--------------------------------

<*> В соответствии с Методическими указаниями МЗ СССР по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М. 1977. Можно определять аминный азот и другими методами.

 

Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при pH = 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Реактивы:

1. Едкий натр 0,1 N раствор.

2. Соляная кислота 0,1 N раствор.

3. Формалин (40-процентный раствор формальдегида). Перед каждым определением pH формалина доводят до 7,0.

Ход определения

Для анализа используют определенный объем "В" жидкого образца. "В" равно для жидких гидролизатов низкой степени расщепления (0,1 - 0,2% аминного азота) - 3 мл; средней степени расщепления (0,3 - 0,6% аминного азота) - 1 мл; высокой степени расщепления (0,7 - 1,3% аминного азота) - 0,5 мл; для жидких питательных сред (0,08 - 0,14% аминного азота) - 3 мл; для жидких экстрактов (0,02 - 0,04% аминного азота) - 10 мл.

В стакан емкостью 50 мл наливают объем "В" анализируемого раствора образца и доводят общий объем дистиллированной водой до 20 мл. Электроды потенциометра погружают в исследуемый раствор, pH которого доводят до 7,0 с помощью 0,1 N раствора NaOH или 0,1 N раствора соляной кислоты. Во время определения электроды должны оставаться погруженными в раствор. К нейтрализованному раствору добавляют 2 мл нейтрального формалина, перемешивают и, не вынимая электродов, титруют содержимое 0,1 N раствором едкого натра до pH 9,1. При титровании следует использовать микробюретку на 5 мл.

Содержание аминного азота в исследуемом образце в %, (X) вычисляют по формуле:

 

                              А х К х 1,4 х 100

                          X = -----------------,

                                  В х 1000

 

где:

А - количество 0,1 N раствора NaOH в мл, пошедшее на титрование испытуемой пробы;

К - поправка к титру 0,1 N раствора NaOH;

1,4 - количество аминного азота в мг, эквивалентное 1 мл 0,1 N раствора NaOH;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

В - количество жидкого образца в мл, взятое на анализ;

1000 - коэффициент пересчета мг в г.

Методика приготовления крови, кровяных и кровяно-теллуритовых смесей

Используют самые разнообразные источники получения крови и кровяных смесей. Лучшей кровью является дефибринированная кровь скота (крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец), полученная на мясокомбинатах или бойнях, дефибринированная кровь лабораторных животных - кроликов. Эту кровь забирают в стерильные бутыли с бусами стерильным полым ножом, монтируя специальные системы с соблюдением всех правил асептики. В отдельных случаях кровь собирают, не монтируя специальных систем, сливая первые порции крови вне бутыли.

Можно использовать кровь человека со станций переливания крови (цитратную и с консервантами), приготовляя из нее специальные кровяные смеси. Необходимым условием является сбрасывание жидкой отстоявшейся части крови с цитратом или другими консервантами. В оставшуюся эритроцитарную массу нужно добавить столько же, сколько слили жидкой части крови, стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора, или сыворотки крупного рогатого скота (без консерванта) и теллурита калия. Вместо слитой жидкой части при приготовлении среды Клауберга можно добавлять глицерин.

Хорошим сырьем для получения кровяной смеси служат отходы гамма-глобулинового производства. Эритроцитарная масса (нестерильная) после нескольких центрифугирований (по производственной технологии) сбрасывается в гамма-глобулиновом производстве. Эти отходы заливают стерильной дистиллированной водой или глицерином из расчета 1/4 - 1/5 объема эритроцитарной массы и добавляют теллурит калия.

Можно использовать кровяные сгустки после отсасывания сыворотки для производства гамма-глобулина, сгустки плацентарной крови, полученной непосредственно от рожениц, сгустки абортной крови и сгустки после отрицательных серологических реакций. Сгустки собирают в стерильные бутыли со стеклянными бусами или битым стеклом и разбивают их. В случае когда не удается разбить бусами, сгустки замораживают и оттаивают (бутыль со сгустками помещают на сутки в морозильную камеру, после чего они легко разрушаются). Эту манипуляцию можно повторить 2 - 3 раза. Затем добавляют стерильный физиологический раствор или дистиллированную воду 1/5 - 1/4 объема сгустков и теллурит калия.

Для лучшего сохранения крови или кровяной смеси (дефибринированной, отходов гамма-глобулинового производства или сгустков) к каждой порции в 10 - 15 мл, добавляемой на 100 мл агара, приливают 1 мл 2-процентного раствора теллурита калия. Такую кровяную теллуритовую смесь можно сохранять в холодильнике до 2-х месяцев.

При приготовлении кровяной теллуритовой среды на каждые 100 мл растопленного питательного агара добавляют от 11 до 16 мл кровяной теллуритовой смеси и 1,0 мл 2-процентного раствора теллурита калия. Пример расчета: к 200 мл эритроцитарной массы со станции переливания крови после того, как слили 30 мл жидкой отстоявшейся части крови с консервантом, добавили столько же - 30 мл сыворотки крупного рогатого скота (без консерванта) или дистиллированной воды, или физиологического раствора. Таким образом, получили 230 мл кровяной смеси, что составляет, примерно, 21 добавку к агару, если добавлять по 11 мл этой кровяной смеси к каждым 100 мл агара. Для консервирования 230 мл кровяной смеси необходимо добавить половину порции теллурита калия, следовательно, 21 мл. В дальнейшем готовить кровяные теллуритовые среды нужно следующим образом - к 100 мл агара добавить 12 мл кровяной теллуритовой смеси и 1 мл 2-процентного раствора теллурита калия.

Приготовление и стерилизация тампонов

Для приготовления тампонов используют деревянные или металлические палочки (для транспортной среды из неокисляющегося металла), на один из концов которых плотно накручивается слой гигроскопической ваты (примерно 120 мг ваты на тампон). Тампоны монтируют в пробирки с корковыми или ватными пробками так, чтобы тампон не касался дна пробирки.

Стерилизовать тампоны можно в сушильном шкафу при температуре 140 - 150° в течение часа или в автоклаве при температуре 112° в течение 30 минут.

Рецепты красок

1. Щелочная метиленовая синь Леффлера:

Дистиллированная вода - 99 мл.

1-процентный раствор едкого калия (KOH) - 1 мл.

Профильтрованный спиртовой раствор метиленовой сини (3 г метиленовой сини на 30 мл спирта) - 30 мл.

Окрашивать в течение 1 - 2 мин.

2. Уксуснокислая толуидиновая синь:

Толуидиновая синь - 0,25 - 0,5 г.

Ледяная уксусная кислота - 2 мл.

96° этиловый спирт - 5 мл.

Дистиллированная вода - 100 мл.

Окрашивать в течение 3 - 5 мин.

3. Метил-виолет или кристалл-виолет:

Метил-виолет или кристалл-виолет - 0,25 г.

5-процентный раствор уксусной кислоты - 100 мл.

Профильтровать.

Окрашивать в течение 5 - 10 мин.

4. Катионный синий - О (бензтиазоловый азокраситель).

5. Метиленовый голубой технический (тиазиновый краситель).

Для 4 и 5 красителей рецепт приготовления одинаков:

Дистиллированная вода - 100 мл.

Профильтрованный спиртовой раствор 4-го или 5-го красителя (1 г красителя на 10 мл спирта находится в термостате при 37° в течение суток) - 10 мл.

Окрашивать в течение 1 - 3 минут.

При приготовлении красок по любому из вышеуказанных методов следует помнить, что краски при длительном хранении в разведенном состоянии могут утрачивать свои свойства, поэтому их следует хранить не более месяца в темном месте во флаконах темного стекла.

    Приготовление теллурита калия (K TeO )

                                    2   3

Для приготовления теллуритовых сред используют готовый 2-процентный раствор теллурита калия в 40-процентном растворе глицерина, выпускаемый салициловым предприятием Московского химфармообъединения им. Семашко в стеклянных ампулах.

В случае отсутствия готового раствора теллурита калия его готовят следующим образом. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г теллурита калия. Раствор стерилизуют нагреванием в кипящей бане в течение 30 мин. и сохраняют при комнатной температуре. В случае выпадения осадка раствор вновь прогревают в водяной бане до полного растворения осадка. При плохой растворимости порошкообразного теллурита готовят 1-процентный раствор, но соответственно добавляют его к средам в двойном объеме. Порошкообразный теллурит калия необходимо хранить в банке темного стекла с притертой пробкой, учитывая его гигроскопичность. Раствор проверяют, приготовив среды, титрованным количеством коринебактерий дифтерии и стафилококка в соответствии с описанной методикой.

 

Заместитель начальника Главного

управления карантинных инфекций

Минздрава СССР

М.И.НАРКЕВИЧ