Утвержден
Постановлением
Государственного комитета СССР
по стандартам
от 1 августа 1986 г. N 2321
Дата введения -
1 июля 1987 года
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
САХАР
МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
SUGAR.
METHODS OF
MICROBIOLOGICAL ANALYSIS
ГОСТ 26968-86
(с Изменением N 1, утв. в апреле 1995 г. (ИУС
7-95))
Постановлением Государственного комитета
по стандартам от 1 августа 1986 г. N 2321 дата введения установлена с
01.07.1987.
Ограничение срока действия снято по
протоколу N 2-92 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и
сертификации (ИУС 2-93).
Переиздание с Изменением N 1,
утвержденным в апреле 1995 г. (ИУС 7-95).
Настоящий стандарт распространяется на
сахар-песок, сахар-рафинад, рафинированный сахар-песок и жидкий сахар и
устанавливает методы определения общего количества мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, количества дрожжей и
плесневых грибов.
Методы основаны на
высеве определенного количества раствора сахара в агаризованную
питательную среду, выращивании посевов, подсчете всех выросших видимых колоний,
а для дрожжей и плесневых грибов - колоний, типичных по макро- или
микроскопической морфологии, и определении микроорганизмов в 1 г сахара.
(Измененная
редакция, Изм. N 1)
1. ОТБОР И
ПОДГОТОВКА ПРОБ
1.1. Отбор проб сахара для
микробиологического анализа проводят по ГОСТ 12569-85 и ГОСТ 26668-85.
Пробы от продуктов отбирают асептическим
способом, исключающим микробное загрязнение продукта из окружающей среды.
При отборе проб жидкого сахара из
резервуара, оснащенного краном, кран сначала промывают, вытирают ватой,
пропитанной этиловым спиртом, и обжигают в пламени. Затем выпускают до 500 куб.
см жидкого сахара (в зависимости от вместимости резервуара и диаметра крана) и
только после этого отбирают пробы в посуду, заполняя 3/4 ее объема.
Широкогорлую посуду закрывают ватными
пробками, сверху пробки накладывают чистую бумагу и плотно прижимают ее к горлу
посуды. Банки закрывают крышками, предварительно обработанными этиловым
спиртом, маркируют этикетками с указанием номера резервуара и крана, даты
отбора проб и доставляют на анализ.
1.2. Пробы отбирают стерильным
пробоотборником в стерильную посуду (банки, полиэтиленовые пакеты).
Посуду, инструменты и материалы,
соприкасающиеся с продуктами во время отбора проб, предварительно стерилизуют
одним из следующих способов:
насыщенным паром в стерилизаторе при
температуре (121 +/- 2) °C 30 мин.;
горячим воздухом в стерилизаторе: с
принудительной циркуляцией воздуха при температуре 170 - 175 °C в течение 60
мин.;
без принудительной циркуляции воздуха при
температуре 180 - 185 °C в течение 15 мин., при температуре 165 - 170 °C в
течение 120 мин.
Допускается инструменты обрабатывать
погружением в этиловый спирт с последующим обжиганием.
1.3. Отобранные пробы, предназначенные
для анализа вне предприятия-изготовителя, пломбируют и опечатывают печатью
организации, отвечающей за контролируемую продукцию, и транспортируют в
лабораторию. Пробы снабжают актом отбора проб, в котором указывают наименования
продукта, предприятия-изготовителя, номер партии, дату отбора проб, цель
микробиологического анализа, подписи лиц, отбиравших пробу. Время перевозки до
12 ч с момента отбора проб.
Отбор, транспортирование в лабораторию и
вскрытие проб проводят в условиях, исключающих вторичную микробиальную
обсемененность сахара, в соответствии с методами, утвержденными в установленном
порядке.
(1.1 - 1.3. Измененная редакция, Изм. N 1)
1.4. Анализ проводят сразу же после доставки
сахара в лабораторию.
1.5. Перед вскрытием полиэтиленового
пакета с сахаром его перемешивают 10-кратным переворачиванием или круговым
движением.
Пробы сахара в полиэтиленовых пакетах
вскрывают на столе, предварительно обработанном раствором этилового спирта.
Полиэтиленовые пакеты вскрывают
стерильными ножницами, скальпелем или другим инструментом в месте,
предварительно обработанном тампоном, смоченным раствором этилового спирта,
горлышко банки до и после вскрытия обжигают в пламени спиртовой горелки.
1.6. После вскрытия пакета или банки с
сахаром содержимое перемешивают, стерильными ложкой
или шпателем отбирают навеску и переносят ее в предварительно взвешенную
стерильную посуду.
Навески сахара отбирают немедленно после
вскрытия упаковки, в непосредственной близости от огня.
(1.5, 1.6. Измененная редакция, Изм. N 1)
2. АППАРАТУРА,
МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
2.1. Для проведения анализа используют
следующие аппаратуру, материалы и реактивы:
микроскоп;
термостат;
шкаф сушильный с терморегулятором,
обеспечивающим нагрев до 190 °C;
баню водяную;
весы лабораторные 2-го класса точности с
наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-88;
рефрактометр;
pH-метр;
колбы 2-100-2 по ГОСТ 1770-74 и колбы
Кн-2-250-34 ТС и Кн-2-1000-42 ТС по ГОСТ 25336-82;
палочки стеклянные;
пипетки вместимостью 1, 2 или 5 куб. см;
пробирки П1-16-150 ХС по ГОСТ 25336-82;
стекла покровные по ГОСТ 6672-75;
стекла предметные по ГОСТ 9284-75;
термометры стеклянные ртутные от 0 до 50
°C и от 50 до 100 °C по ГОСТ 28498-90 и нормативным документам;
цилиндры 1(3)-100 по ГОСТ 1770-74;
чашки ЦБН-2 (Петри) по ГОСТ 25336-82;
бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026-76;
вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ
5556-81;
марлю медицинскую по ГОСТ 9412-93;
лупу складную карманную по ГОСТ 25706-83;
ножи и скальпели
медицинские по ГОСТ 21240-89;
пинцеты по ГОСТ 21241-89;
спиртовку по ГОСТ 25336-82 или газовую
горелку;
мясо-пептонный бульон
(МПБ);
агар
микробиологический по ГОСТ 17206-96;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ
5962-67;
спирт этиловый ректификованный
технический по ГОСТ 18300-87;
сусло солодовое неохмеленное;
кислоту лимонную по ГОСТ 908-79, раствор
с массовой долей 20%; готовят следующим образом: 20 г лимонной кислоты
переносят в мерную колбу, доводят объем водой до 100 куб. см, разливают в
пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20
мин.;
пробоотборник или щуп из нержавеющей
стали;
чашка нейзильберовая
вместимостью 150 куб. см.
Допускается применение другой аппаратуры,
лабораторной посуды с метрологическими и техническими характеристиками не ниже установленных в настоящем стандарте.
(Измененная
редакция, Изм. N 1)
3. ПОДГОТОВКА К
АНАЛИЗУ
3.1. Подготовка посуды и материалов
3.1.1. Посуду, предназначенную для
микробиологического анализа, моют, а новую - дополнительно кипятят в
подкисленной воде (раствор соляной кислоты массовой долей 1 - 2%) в течение 15
мин., затем ополаскивают дистиллированной водой и стерилизуют.
Посуду стерилизуют в сушильном шкафу при
температуре 170 °C в течение 2 ч или в стерилизаторе при температуре (121 +/-
2) °C в течение 30 мин. с последующим подсушиванием.
Чашки Петри, пипетки стерилизуют
завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки
предварительно вкладывают кусочек ваты. Резиновые пробки стерилизуют в
стерилизаторе, завернутыми в бумагу.
Стерильную посуду хранят в плотно
закрывающихся шкафах.
(3.1, 3.1.1. Измененная редакция, Изм. N 1)
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Приготовление мясо-пептонного агара
К 1000 куб. см мясо-пептонного
бульона прибавляют 20 г агара,
нагревают на водяной бане до растворения, фильтруют через вату, разливают в
колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
3.2.2. Приготовление солодового
сусло-агара
1000 куб. см неохмеленного
солодового сусла, разбавленного питьевой водой до массовой доли сухих веществ 8
- 10%, фильтруют через вату, прибавляют 20 г агара, нагревают на водяной бане до расплавления агара, затем разливают в стерильные колбочки и стерилизуют
15 мин. при температуре (115 +/- 1) °C.
Среду охлаждают до (45 - 55) °C и
устанавливают pH 3,6 +/- 0,1, добавляя 2 - 3 куб. см
раствора лимонной кислоты с массовой долей 20%. Готовую среду хранят в
холодильнике при температуре (4 +/- 1) °C не более 7 сут.
Если по истечении 7 сут. среда остается стерильной,
то допускается хранение ее в течение 1 мес.
3.3. Проведение серии десятикратных
разведений
В нейзильберовой
чашке, предварительно обработанной этиловым спиртом и обожженной над
спиртовкой, взвешивают 10 г сахара, записывая результат взвешивания до второго
десятичного знака.
Навеску переносят в плоскодонную колбу с
90 куб. см стерильной воды, взбалтывают до полного растворения и получают
первое (исходное) разведение.
Второе разведение готовят из одной части первого
разведения и девяти частей стерильной воды путем смешивания в стерильной колбе
или пробирке.
Разведения готовят до такой степени,
чтобы можно было определить предполагаемое количество микроорганизмов в 1 г
сахара.
При приготовлении разведений растворы
перемешивают стерильной пипеткой путем десятикратного насасывания и выдувания
из нее содержимого.
Интервал между приготовлением навесок или
их разбавлений и высевом в питательные среды не должен превышать 30 мин.
(Измененная
редакция, Изм. N 1)
4. ПРОВЕДЕНИЕ
АНАЛИЗА
4.1. Метод определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов
4.1.1. Из разведений, приготовленных по
п. 3.3, стерильной пипеткой отбирают по 1 или 2 куб. см исследуемого раствора
сахара и высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При
посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают и
посевной материал вносят на дно чашки.
В каждую чашку Петри не позднее чем через
15 мин. добавляют 15 - 20 куб. см питательной среды (мясо-пептонного агара). Чашки
осторожно вращают круговыми движениями, чтобы посевной материал равномерно
распределился по всей питательной среде, и оставляют в горизонтальном положении
до полного застывания. После застывания среды чашки помещают в термостат вверх
дном на (72 +/- 3) ч при температуре (30 +/- 1) °C.
4.2. Метод определения количества дрожжей
и плесневых грибов
Из разведений, приготовленных по п. 3.3,
стерильной пипеткой отбирают по 1 или 2 куб. см исследуемого раствора сахара и
высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве
крышку чашки Петри слегка приоткрывают и посевной
материал вносят на дно чашки. Пробу заливают 15 - 20 куб. см питательной среды
(солодовое сусло-агар).
Чашки осторожно вращают круговыми движениями, чтобы посевной материал
равномерно распределился по всей питательной среде, и оставляют в
горизонтальном положении до полного застывания. После застывания среды чашки
помещают в термостат вверх дном на 120 ч при температуре 24 - 30 °C.
4.3. Бактерии группы кишечных палочек и
патогенных микроорганизмов определяют по методам, утвержденным органами
государственного санитарно-эпидемиологического надзора.
(4.2, 4.3. Измененная редакция, Изм. N 1)
5. ОБРАБОТКА
РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. После термостатирования
через 24 ч для мезофильных аэробных и
факультативно-анаэробных микроорганизмов и через 72 ч для дрожжей и плесневых
грибов проводят предварительный подсчет колоний.
5.2. Окончательный подсчет колоний
проводят через (72 +/- 3) ч для мезофильных аэробных
и факультативно-анаэробных микроорганизмов и через 120 ч для дрожжей и
плесневых грибов.
При окончательном подсчете дрожжевых
колоний допускается их микроскопировать.
Если колоний немного, количество
определяют визуально; если много, то подсчет ведут на 1/4 или 1/8 площади чашки
при помощи лупы, делая затем пересчет на всю чашку и на количество засеянного
сахара.
Колонии микроорганизмов подсчитывают в
каждом из параллельных посевов одного разведения. По результатам подсчета
вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний во всех посевах
одного разведения.
Если имеются колонии, выросшие не из
одного, а из следующих друг за другом разведений, то подсчитывают количество
микроорганизмов в сахаре по результатам подсчета колоний в каждом из этих
разведений раздельно и вычисляют среднее арифметическое значение.
Количество микроорганизмов в 1 г сахара
(X) вычисляют по формуле:
n
a x 10
X = -------,
V
где: a - среднее арифметическое значение
количества микроорганизмов в одном разведении;
n - степень разведения продукта;
V - объем посевного материала, внесенного
в чашку, куб. см.
Полученные результаты округляют:
до числа, кратного 5 - если среднее
арифметическое значение количества микроорганизмов менее 100 (например, 71 до
75; 83 до 85);
до числа, кратного 20 - если среднее
арифметическое значение количества микроорганизмов более 100 и оканчивается
цифрой 5 (например, 115 до 120; 125 до 140);
до числа, кратного 10 - если среднее
арифметическое значение количества микроорганизмов более 100 и не оканчивается
цифрой 5 (например, 116 до 110; 111 до 110; 121 до 120).
Результат
вычислений выражают числом от
1,0 до 9,9,
n
умноженным на 10
, где n - соответствующая степень
разведения
продукта.
2 3
Пример: 75 - 0,75 x 10 ;
1110 - 1,11 x 10 .