Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1987 г. N 4323-87 (фосфамид),

N 4324-87 (диазинон)

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДИАЗИНОНА И ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ

МЕТОДАМИ ТОНКОСЛОЙНОЙ И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

Краткая характеристика препаратов диазинон и фосфамид приведена в Унифицированной методике.

Принцип метода. Метод основан на экстракции диазинона и фосфамида из биологических сред органическими растворителями (хлороформ, ацетон), очистке полученных экстрактов и последующем определении методами ТСХ и ГЖХ.

Метод ТСХ предусматривает использование подвижной фазы на основе гексана, проявляющих реагентов - бромфенолового синего, хлорида палладия, 2,6-дибром-N-хлорхинонимина, нитрата серебра.

Метод ГЖХ предусматривает применение ТИД и ДЭЗ, неподвижных фаз SE-30 или XE-60.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 34.

 

Таблица 34

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИАЗИНОНА

И ФОСФАМИДА В БИОСРЕДАХ (N = 5 И P = 0,95)

 

┌───────────────────┬─────────────┬────────────┬───────────┬─────────────┬─────┐

│   Анализируемый   │Нижний предел│  Среднее   │Стандартное│Доверительный│Метод│

│      объект       │определения, │  значение  │отклонение,│  интервал,  │     │

│                   │   мкг/мл,   │определения,│     %     │      %      │     │

│                   │   мкг/г,    │     %      │           │             │     │

│                   │ мкг/кв. см  │            │           │             │     │

├───────────────────┴─────────────┴────────────┴───────────┴─────────────┴─────┤

│                                    Диазинон                                  │

│                                                                              │

│Желудочный сок,    │0,05         │85,4        │+/- 3,9    │+/- 4,9      │ГЖХ  │

│слюна              │0,25         │78,5        │+/- 6,3    │+/- 7,8      │ТСХ  │

│Желчь              │0,05         │87,2        │+/- 4,1    │+/- 5,1      │ГЖХ  │

│                   │0,25         │80,0        │+/- 6,3    │+/- 7,8      │ТСХ  │

│Моча               │0,002        │95,3        │+/- 4,7    │+/- 5,8      │ГЖХ  │

│                   │0,05         │89,5        │+/- 6,8    │+/- 8,5      │ТСХ  │

│Кровь              │0,05         │90,3        │+/- 3,5    │+/- 4,3      │ГЖХ  │

│                   │0,25         │82,4        │+/- 7,3    │+/- 9,1      │ТСХ  │

│Ткани внутренних   │0,02         │91,7        │+/- 4,7    │+/- 5,8      │ГЖХ  │

│органов, кожа      │0,5          │88,5        │+/- 7,6    │+/- 9,5      │ТСХ  │

│Смывы с поверхности│0,002        │95,6        │+/- 3,7    │+/- 4,6      │ГЖХ  │

│кожи               │0,31         │90,0        │+/- 8,4    │+/- 10,5     │ТСХ  │

│                                                                              │

│                                    Фосфамид                                  │

│                                                                              │

│Желудочный сок,    │0,02         │88,6        │+/- 3,85   │+/- 4,8      │ГЖХ  │

│слюна              │0,25         │78,6        │+/- 6,3    │+/- 7,8      │ТСХ  │

│Желчь              │0,02         │92,0        │+/- 3,4    │+/- 4,2      │ГЖХ  │

│                   │0,25         │82,0        │+/- 7,4    │+/- 9,2      │ТСХ  │

│Кровь              │0,02         │95,2        │+/- 2,8    │+/- 6,0      │ГЖХ  │

│                   │0,25         │85,2        │+/- 6,8    │+/- 8,5      │ТСХ  │

│Моча               │0,0008       │95,1        │+/- 3,7    │+/- 4,6      │ГЖХ  │

│                   │0,01         │89,1        │+/- 6,7    │+/- 8,3      │ТСХ  │

│Кожа               │0,04         │91,1        │+/- 4,5    │+/- 5,6      │ГЖХ  │

│                   │0,5          │87,9        │+/- 7,6    │+/- 9,4      │ТСХ  │

│Ткани внутренних   │0,04         │90,3        │+/- 4,9    │+/- 6,1      │ГЖХ  │

│органов            │0,5          │80,3        │+/- 7,2    │+/- 8,9      │ТСХ  │

│Смывы с поверхности│0,006        │95,2        │+/- 3,5    │+/- 4,3      │ГЖХ  │

│кожи               │0,03         │90,0        │+/- 7,2    │+/- 8,9      │ТСХ  │

└───────────────────┴─────────────┴────────────┴───────────┴─────────────┴─────┘

 

Избирательность метода. Определению диазинона и фосфамида не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе: циклоат, эптам, метоксихлор, линдан.

Реактивы и растворы. Диазинон х.ч. или препаративная форма. Фосфамид х.ч. или 40(38)-процентный к.э. Ацетон х.ч. Гексан ч. Хлороформ х.ч. Натрия цитрат ч. Натрия сульфат безводный ч.д.а. Серебра нитрат х.ч., 0,5-процентный водно-ацетоновый раствор (1:3). Гидроксид натрия х.ч., 20-процентный раствор. Бромфеноловый синий ч.д.а. Кислота лимонная х.ч., 2-процентный раствор. Кислота хлороводородная х.ч., концентрированная и 0,1 н раствор. Хлорид палладия ч. Кальция сульфат безводный х.ч.

Проявляющие реагенты: N 1 - бромфеноловый синий (взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и далее разбавляют до 100 мл раствором нитрата серебра. Срок хранения в холодильнике 1 мес.); N 2 - хлорид палладия (взвешивают 0,2 г хлорида палладия, вносят в колбу вместимостью 100 мл, приливают 2 капли концентрированной хлороводородной кислоты, помещают колбу в водяную баню при 60 - 70 °C на 10 - 15 мин. Периодически встряхивают до полного растворения содержимого колбы. Доводят объем раствора до 100 мл водой. Срок хранения реактива в холодильнике 1 мес.); N 3 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин х.ч., 0,5-процентный раствор в гексане; N 4 - нитрат серебра (взвешивают 1 г нитрата серебра и растворяют в 99 мл воды. Опрыскивают пластинки проявляющим реагентом N 4 после гидролиза 20-процентным раствором гидроксида натрия. Хранят реактив в холодильнике до 2 недель).

Для определения фосфамида подвижная фаза: хлороформ - ацетон - гексан (3:1:1) или гексан - ацетон (3:2), для определения диазинона - гексан - ацетон (2:1 или 3:1).

Стандартный раствор фосфамида, диазинона с содержанием 100; 10; 2 и 0,2 мкг/мл в гексане или ацетоне для ГЖХ, 100 мкг/мл в хлороформе - для ТСХ. Если стандартный раствор готовят из препаративной формы пестицида, то учитывают содержание действующего вещества, при необходимости фильтруют. Срок хранения стандартных растворов, содержащих 100 мкг/мл, до 1 мес. в холодильнике.

Азот, водород в баллонах с редукторами. Азот особой чистоты (содержание кислорода не более 0,003%).

Насадка хроматографической колонки: при использовании ТИД - хроматон N-AW-DMCS + 5% SE-30 (анализ фосфамида), хроматон N-AW-DMCS + 5% XE-60 (анализ диазинона); при использовании ДЭЗ или ДПР - хроматон N-AW-DMCS + 5% XE-60 (0,16 - 0,20 мм).

Оксид алюминия II степени активности для хроматографии. Сульфат кальция безводный ч.д.а.

Хроматографические пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 см. Для приготовления хроматографических пластинок с оксидом алюминия 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш, смешивают с 5 г безводного сульфата кальция и 75 мл воды, встряхивают до образования однородной массы; наносят тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером 9 x 12 см; сушат на воздухе 12 ч; хранят в эксикаторе.

Приборы и посуда. Газовый хроматограф с ТИД, ДЭЗ или ДПР. Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб или аналогичный аппарат для отгонки растворителей. Аппарат для встряхивания. Термостат. Колбы мерные, цилиндры. Пипетки, микропипетки. Воронки химические и делительные. Хроматографическая камера. Камера для опрыскивания пластинок. Пульверизатор стеклянный. Баня водяная. Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки. Стеклянные пластинки размером 9 x 12 см. Микрошприц МШ-10. Колонки стеклянные хроматографические длиной 1 м с внутренним диаметром 3 мм. Секундомер. Линейка измерительная. Лупа измерительная.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. К 2 мл пробы слюны, желчи, желудочного сока приливают 0,5 мл воды, 3 мл хлороформа и осторожно встряхивают на холоде 30 мин. Отделяют органический слой. Экстракцию проводят еще дважды порциями растворителя по 3 мл. Экстракты объединяют, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), фильтруют. Отгоняют растворитель примерно до объема 0,2 - 0,5 мл.

К 50 мл мочи приливают 5 мл воды, 10 мл хлороформа и экстрагируют, осторожно встряхивая в течение 30 мин. Экстракцию проводят трижды порциями хлороформа по 10 - 20 мл. Органический слой отделяют, объединяют и далее поступают так же, как с пробами слюны.

Пробу крови (2 мл) отбирают в пробирку, смоченную 5-процентным раствором цитрата натрия. Приливают 4 мл хлороформа и осторожно встряхивают на холоде 20 мин. Органический слой отделяют, фильтруют, пропускают через безводный сульфат натрия. Экстракцию проводят дважды порциями растворителя по 4 мл. Далее поступают так же, как с пробами слюны.

Пробу кожи, тканей внутренних органов предварительно выдерживают в морозильнике 1 - 2 ч. Пробу массой 1 г тщательно измельчают, растирают в фарфоровой ступке, приливают 4 мл охлажденного ацетона и содержимое переносят в склянку с притертой пробкой. Встряхивают на холоде в течение 30 - 40 мин. Органический слой сливают, фильтруя через безводный сульфат натрия. Экстракцию повторяют еще дважды свежими порциями ацетона. Объединенный экстракт переносят в колбу для отгонки растворителей и отгоняют ацетон примерно до объема 0,2 - 0,5 мл. Остаток раствора подсушивают безводным сульфатом натрия.

Анализ методом ТСХ. Пробу 0,2 - 0,5 мл количественно наносят на хроматографическую пластинку, параллельно на эту же пластинку наносят стандартные растворы пестицида, содержащие 0,5 - 10 мкг. Помещают пластинку в хроматографическую камеру, куда предварительно (за 20 - 30 мин.) наливают подвижную фазу. После поднятия фронта растворителя на высоту 10 - 12 см пластинку извлекают из камеры и дают улетучиться следам растворителя. Затем применяют один из проявляющих реагентов. Если хроматографирование проводят на пластинках "Силуфол", то используют проявляющие реагенты N 1, 2, 3 (диазинон, фосфамид).

Через 15 - 20 мин. после опрыскивания пластинки проявляющим реагентом N 1 ее опрыскивают 5-процентным раствором лимонной кислоты. Пестициды и некоторые метаболиты окрашиваются в синий, темно-голубой, сине-зеленый цвет на светло-желтом фоне пластинки. Если применяют проявляющий реагент N 2, то сразу после опрыскивания фосфамид окрашивается в светло-коричневый цвет, иногда с желтоватым оттенком, а диазинон - в желтый цвет.

После опрыскивания проявляющим реагентом N 3 пластинку следует поместить в сушильный шкаф при 110 - 115 °C на 2 - 3 мин. На светлом фоне пластинки зоны локализации пестицидов и их фосфорорганических аналогов окрашиваются в ярко-красный и рубиново-желтый цвета соответственно, а других метаболитов - в розово-красный цвет.

    Величина  R   фосфамида 0,55 - 0,6; кислородного аналога (P-O)

               f

фосфамида  -  0,2  -  0,25.  Величина  R   диазинона  -  0,45; его

                                        f

метаболитов:  диазоксона  (P-O-диазинона)  -  0,3;  2-изопропил-N-

метил-6-гидроксипиримидина       -       0,1;       2-изопропил-6-

меркаптопиримидина - 0,6; тетраэтилпирофосфата - 0,7.

    Если  хроматографирование  проб, содержащих фосфамид, проводят

на  пластинках  с  оксидом  алюминия  с  использованием в качестве

подвижного   растворителя  хлороформа,  то  применяют  проявляющий

реагент  N  4.  После  улетучивания  следов  хлороформа  пластинку

обрабатывают 20-процентным раствором гидроксида  натрия,  а  после

подсушивания  слоя - проявляющим реагентом N 4. Пластинку помещают

в  сушильный шкаф при 105 °C на 5 мин.; фосфамид и его кислородный

аналог  проявляют  в виде серо-черных пятен. Величина R  фосфамида

                                                       f

0,4; кислородного аналога - 0,1 - 0,15.

Анализ методом ГЖХ. Экстракцию диазинона и фосфамида из биологических проб (желчь, желудочный сок, кровь, моча, кожа, ткани внутренних органов) проводят так же, как для определения методом ТСХ. Полученные экстракты при комнатной температуре упаривают до сухого остатка. К сухому остатку приливают 1 мл гексана или ацетона и аликвотную часть пробы (2 - 5 мкл) вводят в хроматограф (табл. 35).

 

Таблица 35

 

УСЛОВИЯ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

 

┌──────────────────────────┬───────────────────────┬──────────────────────┐

│      Характеристики      │         ТИД           │         ДЭЗ          │

├──────────────────────────┼───────────────────────┼──────────────────────┤

│Насадка                   │Хроматон + 5% SE-30    │Хроматон + 5% XE-60   │

│                          │(фосфамид)             │                      │

│                          │Хроматон + 5% XE-60    │                      │

│                          │(диазинон)             │                      │

│Температура, °C:          │                       │                      │

│  колонки                 │180                    │180                   │

│  испарителя              │230                    │220 - 230             │

│  детектора               │-                      │190                   │

│Расход, мл/мин.           │                       │                      │

│  азота                   │20 - 25                │40 - 60               │

│                          │                       │(азот особой чистоты) │

│  водорода                │20                     │-                     │

│  воздуха                 │200 - 240              │240 (для ДПР)         │

│                          │       -12             │              -12     │

│Чувствительность шкалы    │50 x 10                │(20...50) x 10        │

│электрометра, А           │                       │                      │

│Минимально детектируемое  │0,2                    │0,5 (фосфамид),       │

│количество, нг            │                       │2 (диазинон)          │

└──────────────────────────┴───────────────────────┴──────────────────────┘

 

Примечание. Режим работы изотермический. Длина колонки 1 м, диаметр 3 мм. Время выхода, мин.: фосфамида 2,1 - 4,8; фосфорорганического аналога фосфамида 1,5 - 5,6; диазинона 1,5 - 2,8; диазоксона - 3,1.

 

Обработка результатов анализа. Анализ методом ТСХ. С помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют площадь пятен пестицида на хроматограмме пробы и стандартных растворов. Можно построить градуировочный график зависимости площади пятна от концентрации и по графику найти концентрацию фосфамида в хроматографируемой пробе. Для расчета можно использовать формулу. Измеряют площадь того пятна на хроматограмме стандарта, которое по размерам наиболее близко к пятну на хроматограмме пробы.

Анализ методом ГЖХ. Количественную обработку результатов анализа проводят методом абсолютной калибровки. Для этого строят градуировочный график зависимости площади от концентрации, вводя в хроматограф по 2 - 5 мкл стандартных растворов фосфамида и диазинона, содержащих 0,2 - 20 мкг/мл. По градуировочному графику находят концентрацию пестицидов в хроматографируемой пробе. При анализе проб параллельное определение проводят не менее трех раз. Для расчета можно воспользоваться формулой, измерив площадь пика на хроматограмме стандарта, наиболее близкого по размерам к пику на хроматограмме пробы, и полученные величины подставить в формулу.

Расчет количества пестицидов в пробе (X, мкг/г, мкг/мл) проводят по формуле:

 

                               CS  V

                                 пр

                           X = ------,

                               S  V P

                                ст 1

 

    где:

    C - количество пестицида на хроматограмме стандарта, мкг;

    S    -  площадь  пятна  (ТСХ)  или пика (ГЖХ) на хроматограмме

     ст

стандарта, кв. мм;

    S    -  площадь  пика  (ГЖХ)  или пятна (ТСХ) на хроматограмме

     пр

пробы, кв. мм;

    V - общий объем экстракта пробы, мл;

    V  - хроматографируемый объем экстракта пробы, мл;

     1

    P - навеска или объем пробы, г или мл.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать правила безопасности при работе в химической лаборатории с ядовитыми веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.