Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1987 г. N 4362-87

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО СИСТЕМАТИЧЕСКОМУ ХОДУ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД

НА СОДЕРЖАНИЕ ПЕСТИЦИДОВ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

 

Методические указания направлены на определение микроколичеств пестицидов различного химического строения (фосфорорганические, хлорорганические; производные карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты; производные динитрофенолов, симм-триазина и др.) в биологических средах: кровь, моча, желчь, желудочный сок, слюна, грудное молоко.

Схема анализа биосред позволяет идентифицировать и определить количественно пестициды в одной пробе по методикам, утвержденным Минздравом СССР.

Методические указания могут быть использованы токсикологическими лабораториями санитарно-эпидемиологических станций, профпатологической службой, НИИ при изучении состояния здоровья сельскохозяйственных рабочих, контактирующих с пестицидами, населения, а также в случаях острой и хронической интоксикации пестицидами.

Принцип метода. В основе систематического определения пестицидов в биологическом материале лежит извлечение пестицидов из биологической пробы диэтиловым эфиром, разделение эфирного экстракта на 3 части, в одной из которых определяют фосфорорганические пестициды, в другой - хлорорганические, в третьей - производные карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты и динитрофенолы (рис. 17). Из биологической пробы после экстракции диэтиловым эфиром извлекают производное симм-триазина смесью гексан - ацетон, в оставшейся биопробе после извлечения метазина определяют зоокумарин. Для аналитического определения используют методы ГЖХ, ТСХ, ТСХЭ и спектрофотометрический.

 

 

                                    ┌────────────────────┐

                                    │ Биологическая проба│

                                    └──────────┬─────────┘

                                               \/

                                   ┌───────────────────────┐

                                   │Высаливание 1%-ным NaCl│

                                   └───────────┬───────────┘

                                               \/

                                      ┌─────────────────┐

                                      │   I экстракция  ├──────────────┐

                                      │диэтиловым эфиром│              │

                                      └────────┬────────┘              \/

                                               │                ┌────────────┐  ┌─────────────┐

             ┌──────────────┐                  \/               │  Биопроба  │  │II экстракция│

             │Сухой остаток,│             ┌───────────┐         │   после    ├─>│   смесью    │

      ┌──────┤   добавить   │<────────────┤  Эфирный  │         │I экстракции│  │   гексан -  │

      │      │ 5 мл гексана │          ┌──┤  экстракт ├──┐      └────────────┘  │   ацетон    │

      │      └──────────────┘          │  └───────────┘  │                      └┬─────┬──────┘

      \/                               \/                \/                ┌─────┘     \/

┌───────────┐   ___    ___     ┌──────────────┐  ┌─────────────┐           │    ┌─────────────┐

│Определение│  /ТСХ\  /ГЖХ\    │Сухой остаток,│  │ Определение │           │    │  Биопроба   │

│ ХОП, ПХБ  ├─>\___/  \___/    │   добавить   │  │тиокарбаматов│           \/   │   после     │

└─────┬─────┘   /\     /\      │ 5 мл ацетона │  └┬──┬───────┬─┘    ┌──────────┐│II экстракции│

      \/        │      │       └──────┬───────┘   │  │       │      │Гексановый│└───────┬─────┘

┌───────────┐   │ ┌────┘              \/          \/ │       │      │ экстракт │        │

│ Очистка   ├───┘ │ ┌────────┐ ┌──────────────┐  ___ │       │      └──────┬───┘        │

│конц. H SO ├─────┘ │Щелочной│ │ Определение  │ /ГЖХ\│       │             │            \/

│       2  4├──────>│гидролиз│ │     ФОП      │ \___/│       \/            \/     ┌───────────┐

└─────┬─────┘       └┬───┬───┘ └─┬────┬────┬──┘      │┌───────────┐ ┌───────────┐ │ Обработка │

      │       ┌──────┘   \/      │    │    │         ││Определение│ │Определение│ │ 1 н H SO  │

┌─────┴────┐  │  ┌───────────┐   \/   │    \/        ││карбаматов │ │ метазина  │ │      2  4 │

│Окисление │<─┘  │Определение│  ___   │   ___        │└──┬───┬────┘ └─┬─────────┘ └─────┬─────┘

│ хромовым │     │ ХОП, ПХБ  │ /ТСХ\  │  /ГЖХ\       \/  │   │        \/                \/

└─────┬────┘     └─┬───────┬─┘ \___/  │  \___/      ___  │   │       ___     ___  ┌───────────┐

      │            \/      │          \/           /ТСХ\<┘   │      /ТСХ\   /ГЖХ\ │Экстракция │

      │            ___     │         ___           \___/     │      \___/   \___/ │хлороформом│

      │           /ГЖХ\    │        /ХЭМ\            /\      │        /\      /\  └┬──────────┘

      │    ┌─────>\___/    \/       \___/            │       \/       │       │    │

┌─────┴────┴┐             ___                    ┌───┴──────────┐   ┌─┴───────┴─┐  │      ___

│Определение│            /ТСХ\                   │ Определение  │   │Определение│<─┘     /СФ \

│    ПХБ    ├───────────>\___/                   │динитрофенолов│   │зоокумарина├───────>\___/

└───────────┘                                    └──────────────┘   └───────────┘

 

 

Рис. 17. Систематический ход определения пестицидов

в биологических средах

 

Ход анализа. Экстракция. Пробу биологической жидкости (5 мл крови, слюны, желчи, желудочного сока; 25 - 50 мл мочи, грудного молока) смешивают с 1 мл 1-процентного раствора хлорида натрия. К полученному раствору приливают диэтиловый эфир (кровь, слюна, желудочный сок, желчь - по 5 мл, моча и грудное молоко - по 10 мл) и экстрагируют в делительной воронке, осторожно встряхивая, 30 - 40 мин. Экстракт сливают в мерный цилиндр. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют. Измеряют объем объединенного эфирного экстракта и делят на 3 части, каждую из которых анализируют в соответствии со схемой.

К оставшейся биопробе после экстракции диэтиловым эфиром приливают смесь гексан - ацетон 10 мл и оставляют на 1 ч, периодически встряхивая. Гексановый экстракт отделяют, экстракцию повторяют еще дважды. Объединенный гексановый раствор пропускают через безводный сульфат натрия (анализируют метазин).

К биологической пробе после экстракции смесью гексан - ацетон приливают 1 н раствор серной кислоты и перемешивают. Экстрагируют зоокумарин хлороформом.

Определение хлорорганических пестицидов и полихлорированных дифенилов. Экстракт (1/3 часть) упаривают досуха и к сухому остатку приливают 5 мл гексана. В гексановом растворе методом ТСХ можно определить хлорорганические пестициды ДДТ, ДДД, ДДЭ [1] и полихлорпинен, полихлоркамфен в присутствии ДДТ и его продуктов превращения [2, 3].

Если определению ХОП мешают коэкстрактивные вещества, экстракт очищают концентрированной серной кислотой. Таким способом определяют ХОП в крови [3, 4].

В случае если анализируют хлорорганические пестициды в присутствии полихлорированных дифенилов (ПХД), после очистки экстракта концентрированной серной кислотой (контроль очистки осуществляют методами ТСХ и ГЖХ) проводят щелочной гидролиз, после которого в гексановом экстракте определяют ХОП и ПХД методами ГЖХ и ТСХ. Если в этом случае анализ исследуемых соединений затруднен, проводят последующее окисление хромовым ангидридом и после этого анализируют экстракт на наличие ПХД методами ГЖХ и ТСХ [4, 5].

Определение фосфорорганических пестицидов. Эфирный экстракт (1/3 часть) осторожно упаривают досуха и к сухому остатку приливают 5 мл ацетона и анализируют хроматоферментным методом (ХЭМ). Для этого на одну из хроматографических пластинок наносят пробу объемом до 50 мкл и стандартные растворы метафоса и ДДВФ, на другую - пробу и стандартные растворы хлорофоса, на третью - пробу и стандартный раствор метафоса. Хроматографируют в подвижной фазе хлороформ 1-ю и 3-ю пластинку, в подвижной фазе гексан - ацетон (1:1) - 2-ю пластинку. Анализируют по методике без активации 1-ю пластинку (обнаружение диброма, ДДВФ, хлорофоса, циодрина, рицида, фенитрооксона, P-O фталофоса). На 2-й пластинке после активации в парах аммиака можно обнаружить ДДВФ и хлорофос, на 3-й пластинке после активации бромом и УФ-светом обнаруживают афуган, абат, антио, валексон, байтекс, фталофос, цидеал, фенкаптон, фозалон, метафос, метилнитрофос, карбофос, цианокс, фосфамид, корал [6].

После идентификации ТСХЭ можно провести анализ этой же пробы (ацетоновый раствор) методами ТСХ и ГЖХ на содержание фозалона и мильбекса [7], сайфоса [8], базудина, фосфамида [9, 10]. При анализе биологической пробы на содержание трихлорметафоса-3 ацетоновый раствор упаривают досуха, к сухому остатку приливают 1 мл гексана и анализируют методом ГЖХ [11].

Определение производных карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты, динитрофенолов. Исследуемый эфирный экстракт анализируют на газовом хроматографе в интервале температур от 140 до 160 °C в режиме программирования на неподвижной фазе ДС-550, или в изотермическом режиме при 140 °C на фазе XE-60, или 160 °C на фазе SE-30 для идентификации тиокарбаминовых пестицидов: вернама, ронита, сутана, тиллама, эптама и ялана. Если определению мешают коэкстрактивные вещества, то эфир осторожно, при комнатной температуре упаривают досуха (тиокарбаминовые пестициды достаточно летучие вещества), приливают 1 мл гексана и далее анализируют гексановый раствор [12]. Ронит и триаллат можно определить методом ТСХ [13, 14].

Аликвотную часть исследуемого раствора наносят на хроматографическую пластинку и определяют производные N-фенилкарбаминовой кислоты - карбин, ИФК, хлор-ИФК [15], бетанал [16], севин [17], дикрезил - в присутствии севина, мезурола и их метаболитов [18].

Аликвотную часть экстракта анализируют на содержание производных динитрофенолов - акрекса, каратана и продуктов превращения акрекса - диносеба методом ТСХ [19].

Характерные реакции: для обнаружения производных карбаминовой кислоты - азосочетание; тиокарбаминовой - N-хлорирование и взаимодействие с о-толидином или взаимодействие с бромфеноловым реагентом; для производных динитрофенолов - реакция с нингидрином.

Определение производного симм-триазина и зоокумарина. К биологической пробе после экстракции диэтиловым эфиром приливают смесь гексан - ацетон (1:1) и трижды экстрагируют производное симм-триазина порциями по 10 мл, оставляя смесь на 1 ч. Гексановый раствор отделяют, объединяют 3 порции и далее анализируют по методике метазина [20].

После отделения гексанового экстракта, содержащего метазин, к оставшейся пробе приливают 1 мл 1 н раствора серной кислоты, содержимое перемешивают, приливают 75 мл хлороформа и далее по методике определяют зоокумарин методами ГЖХ, ТСХ или спектрофотометрическим [21].

Если известны пестициды, объем исследований сужается и используется та часть схемы, в которую они могут входить.

В основу разработки положены:

1. Определение ДДТ, ДДЭ, ДДД, альдрина, дильдрина, гептахлора, кельтана, метоксихлора, эфирсульфоната и других ядохимикатов в воде, продуктах питания, кормах и биологических средах хроматографией в тонком слое // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 9 - 15.

2. Определение альдрина, гексахлорана, гептахлора, ДДТ, ДДД, ДДЭ в воде, овощах, фруктах и биологическом материале газожидкостной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 17 - 20.

3. Определение полихлорпинена и полихлоркамфена в воздухе, воде, почве, картофеле и свекле, мясе, молоке, тканях внутренних органов животных, крови, моче тонкослойной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 62 - 69.

4. Методические указания по избирательному газохроматографическому определению хлорорганических пестицидов в биологических средах. N 3151-84 от 27.11.84 (см. с. 19 - 25).

5. Методические указания по определению хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов при их совместном присутствии в объектах внешней среды и биоматериале // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1983. С. 10 - 18.

6. Методические указания по определению фосфорорганических пестицидов в растительных продуктах и биологических субстратах энзимохроматографическим методом. М.: Колос, 1983. С. 122 - 127.

7. Методические указания по определению фозалона и мильбекса в биологическом материале методом газожидкостной хроматографии. М.: Колос, 1983. С. 105 - 106.

8. Определение сейфоса в воде, продуктах питания растительного происхождения, почве, биологическом материале и воздухе тонкослойной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 133 - 137.

9. Методические указания по определению диазинона в биологических средах тонкослойной и газожидкостной хроматографией. N 4324-87 от 08.06.87 (см. с. 117 - 122).

10. Методические указания по определению фосфамида в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии. N 4323-87 от 08.06.87 (см. с. 117 - 122).

11. Методические указания по определению трихлорметафоса-3 и его метаболитов в биоматериале методом газожидкостной хроматографии // Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. N 2647-82 от 28.12.82 (см. с. 148 - 150).

12. Методические указания по определению гербицидов производных тиокарбаминовой кислоты (вернаам, ронит, сутан, тиллам, эптам, ялан) в воде, почве, растительном материале, биосубстратах и воздухе газохроматографическим методом. N 1877-78 от 05.06.78 (см. с. 388 - 393).

13. Определение триаллата в крови, моче, тканях внутренних органов животных тонкослойной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов. М.: Колос, 1977. С. 296 - 297.

14. Определение карбина, ИФК и хлор-ИФК в растительном материале и воде хроматографией в тонком слое. М.: Колос, 1977. С. 233 - 235.

15. Методические указания по определению ронита в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии. N 4668-88 от 07.07.88 (см. с. 383 - 388).

16. Методические указания по определению бетанала в биологических средах методом хроматографии в тонком слое // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1983. С. 148 - 150.

17. Методические указания по определению севина в биологических субстратах и воде методом тонкослойной хроматографии. М.: Колос, 1983. С. 162 - 163.

18. Определение дикрезила в биологических средах тонкослойной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 197 - 199.

19. Определение каратана, акрекса в воздухе, воде, огурцах, яблоках, биологическом материале и диносеба в биологическом материале тонкослойной хроматографией. М.: Колос, 1977. С. 225 - 230.

20. Методические указания по определению метазина в воде, почве, овощах и биологическом материале методом хроматографии в тонком слое сорбента // Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Ч. XI. М.: МСХ СССР, 1981. С. 181 - 187.

21. Методические указания по определению зоокумарина в тканях и крови животных, в приманках и препарата (пенокумарин) хроматографическим и спектрофотометрическими методами // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1983. С. 227 - 231.