Утверждаю

Заместитель начальника Главного

санитарно-эпидемиологического

управления Минздрава СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

10 июля 1987 г. N 4399-87

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТИАМИНА (ВИТАМИНА B1) В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

 

Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов.

 

Для определения тиамина в пищевых продуктах, обогащенных и не обогащенных этим витамином, используют флюорометрический метод. Он прошел широкую апробацию в различных лабораториях научных и практических учреждений, принимавших участие в подготовке справочных "Таблиц химического состава продуктов", рекомендован Междуведомственной комиссией по составлению этих таблиц и одобрен Минздравом СССР.

 

Принцип метода

 

Тиамин в щелочной среде под действием железосинеродистого калия количественно окисляется в тиохром, который в ультрафиолетовом свете обладает сине-голубой флюоресценцией (максимум возбуждения при 365 нм и максимум флюоресценции при 436 нм). Интенсивность флюоресценции тиохрома прямо пропорциональна содержанию тиамина. Освобождение связанных форм тиамина достигают с помощью кислотного гидролиза и при воздействии протеолитических и фосфатазных ферментов. Мешающие флюорометрическому определению соединения удаляют обработкой изобутиловым спиртом или на колонках с ионообменными смолами.

 

Оборудование

 

Флюориметр ЭФ-3М или ФМ-Ц-2; потенциометр; термостат водяной на 37 °С; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; водяная баня.

 

Посуда

 

Ступка с пестиком; воронки фильтровальные диаметром 5 - 7,5 см; колбы мерные вместимостью 100, 250 и 1000 куб. см; колбы конические вместимостью 100 и 250 куб. см; цилиндры мерные вместимостью 250 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 куб. см. Бюретка с креном на 100 куб. см. Пробирки, цилиндры с притертыми пробками или делительные воронки вместимостью 25 куб. см.

Адсорбционные колонки, состоящие из спаянных между собой концами трубок различного диаметра и длины. Верхняя часть колонки имеет длину 9 - 10 см и диаметр 2,5 - 3,0 см, нижняя - длину 15 см и диаметр 0,7 см и заканчивается краном.

 

Реактивы

 

1. Тиамина хлорид гидрохлорид (Гос. фармакопея СССР, X изд., ст. 674).

2. Калий железосинеродистый, х.ч.

3. Натрий гидроокись, х.ч.

4. Спирт изобутиловый, ч.д.а., с температурой кипения 180° или спирт бутиловый, ч.д.а., с температурой кипения 117 °С. Проверяют спирты на отсутствие флюоресценции (измеряют флюоресценцию спирта в сравнении с дистиллированной водой). Если спирты обладают сильной флюоресценцией, то перед употреблением их очищают активированным углем или перегонкой на глицериновой бане.

5. Натрий уксуснокислый 3-х водный, х.ч.

6. Кислота соляная, х.ч.

7. Калий хлористый, х.ч.

8. Аммиак водный, ч.д.а.

9. Спирт этиловый, ректификат.

10. Ферментные препараты амилоризин П10х или пектаваморин П10х.

11. Катиониты КРС ЗпТ-40, размер частиц 0,5 - 1,0 мм, или СДВ-3Т-40.

 

Приготовление реактивов

 

1. Стандартные растворы тиамина. Растворяют 0,1000 г тиамина хлорида, высушенного в эксикаторе над серной кислотой, в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см и доводят до метки дистиллированной водой (раствор с массовой концентрацией 0,1 мг/куб. см). Раствор сохраняют на холоде в темном месте под слоем толуола. Срок хранения - до 2-х месяцев. Помещают 1 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают (раствор с массовой концентрацией тиамина 0,2 мкг/куб. см). Раствор готовят в день применения.

2. Раствор калия железосинеродистого 1%. Хранить в темном месте не более 2 дней.

3. Раствор натрия гидроокиси 30%.

4. Окислительная смесь. К 2 мл 1% раствора калия железосинеродистого прибавляют 10 куб. см 30% раствора гидроокиси натрия. Смесь пригодна к употреблению в течение 2 - 3 часов.

5. Раствор соляной кислоты 0,1 н.

6. Раствор уксусной кислоты 3%.

7. Насыщенный раствор уксуснокислого натрия.

8. Раствор калия хлористого 25% в 0,1 н растворе соляной кислоты.

9. Спиртовой раствор аммиака: 12 куб. см 25% водного аммиака доводят до 100 куб. см 70% этиловым спиртом.

 

Ход определения

 

Интервал определяемых концентраций тиамина составляет 0,1 - 0,4 мкг/куб. см раствора, поступающего на измерение флюоресценции. Величину навески продукта и последующие разведения рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций.

Навеску мелкоизмельченной средней пробы продукта помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, приливают около 150 куб. см 0,1 н раствора соляной кислоты и кипятят на водяной бане 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры, доводят рН гидролизата до 4,5 (потенциометрически) с помощью насыщенного раствора уксуснокислого натрия, добавляют 100 мг амилоризина, 0,5 куб. см толуола и помещают в термостат на 14 - 16 часов при 37 °С. На следующий день гидролизат охлаждают, доводят объем в мерном цилиндре до 250 куб. см дистиллированной водой и фильтруют. Если исследуемый объект содержит много жира, то навеску перед гидролизом обрабатывают серным эфиром; возможно, также обработать эфиром уже готовый гидролизат.

При анализе объектов, содержащих много пектиновых веществ (яблоки, крыжовник, смородина, тыква, кабачки и продукты их переработки) вместо амилоризина используют пектаваморин. При необходимости прервать анализ на 1 - 2 дня перед доведением объема до 250 куб. см гидролизат кипятят 5 мин., охлаждают, доводят объем до 250 куб. см и фильтруют. До проведения анализа фильтрат хранят в холодильнике в хорошо закрытой склянке. Очистку гидролизатов от соединений, мешающих флюорометрическому определению, проводят одним из двух способов. В случае исследования молочных продуктов, мяса, картофеля от флюоресцирующих примесей освобождаются путем встряхивания фильтратов с бутиловым или изобутиловым спиртом. Для этого в две делительные воронки вместимостью 100 куб. см наливают по 30 куб. см фильтрата от каждой навески, добавляют равный объем изобутилового спирта, встряхивают в течение 3 минут и дают слоям разделиться. После разделения нижний водный слой используют для определения.

При анализе круп, муки, бобовых, жареного мяса и печени, многих овощей, плодов и ягод очистку фильтратов проводят на адсорбционных колонках следующим образом. В нижнюю часть адсорбционной колонки помещают комочек стеклянной ваты и над ним - адсорбент. Набухший катионит переносят в колонку, в которую предварительно на 1/3 ее объема заливают воду, чтобы исключить попадание пузырьков воздуха в пространство между частицами катионита. Высота столбика катионита должна быть 10 - 12 см. Необходимо помнить, что над слоем адсорбента все время должна находиться жидкость. Для перевода катионита в Н-форму перед пропусканием фильтрата через колонку с адсорбентом пропускают 20 куб. см 3% уксусной кислоты, нагретой до 60 - 70 °С. Затем в две адсорбционные колонки вносят по 20 куб. см фильтрата от каждой навески и в две колонки по 20 куб. см стандартного раствора тиамина с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см. После того как весь фильтрат пройдет через колонку (скорость пропускания - 15 капель в минуту), адсорбент промывают 2 - 3 раза дистиллированной водой, порциями по 10 куб. см. Элюцию тиамина с адсорбента проводят горячим 25% раствором хлористого калия в 0,1 н растворе соляной кислоты. Для этого в колбу отмеривают 20 куб. см элюирующего раствора, подогревают его до 60 - 80 °С и пропускают через колонку порциями по 5 - 6 куб. см (элюирующий раствор необходимо подогреть несколько раз). Элюат собирают в мерные цилиндры и, если объем будет несколько меньше, его доводят водой до 20 куб. см. Катионит после регенерации может быть использован повторно.

Регенерацию катионита проводят 30 куб. см доведенного до кипения спиртового раствора аммиака, после чего пропускают дистиллированную воду и перед повторным употреблением 3% уксусную кислоту. Такой обработки катионита бывает недостаточно после пропускания фильтратов, содержащих много естественных пигментов (при анализе ягод и фруктов). Поэтому для удаления из катионита органических примесей в колонку приливают 10% NaOH, оставляют его в контакте с катионитом на 20 - 25 минут. После этого раствор удаляют из колонки, к катиониту приливают новую порцию раствора щелочи. Такую обработку проводят до исчезновения окраски щелочи. Затем катионит промывают водой до нейтральной реакции. Перед адсорбцией тиамина катионит переводят в Н-форму, как указано выше.

Окисление тиамина в тиохром. В 3 пробирки с притертыми пробками отмеривают по 5 куб. см элюата, полученного после пропускания через колонку испытуемого раствора. Затем в два стаканчика с элюатами добавляют по 1,2 куб. см окислительной смеси и в третий - 1,2 куб. см 30% раствора гидроокиси натрия (контроль). Все пробирки энергично встряхивают, прибавляют по 10 куб. см изобутилового спирта и снова энергично встряхивают в течение 3-х минут для извлечения тиохрома. Водный и спиртовой слои разделяют центрифугированием или отстаиванием в темном месте. Таким же образом поступают с полученным после пропускания через колонку элюатом рабочего стандартного раствора тиамина.

    После  разделения  спиртового и водного слоев сливают верхний спиртовой

слой  в  кюветы  для  измерения  интенсивности флюоресценции. Интенсивность

флюоресценции  тиохрома  измеряют  на  флюориметре  со  светофильтрами  для

витамина  B ,   начиная  с  проб  стандартного раствора тиамина. Содержание

           1

тиамина (мг на 100 г продукта) вычисляют по формуле:

 

                               (А - А ) х V х К

                                     1

                        Х = -----------------------,

                            (А  - А ) х V  х а х 10

                              2    3     1

 

    где:

    А - среднее из показаний флюориметра для испытуемого образца;

    А  - показания   флюориметра   для   контрольного   опыта к испытуемому

     1

образцу;

    V - общий объем гидролизата (в куб. см);

    К - концентрация тиамина в стандартном растворе,  взятом  для измерения

интенсивности флюоресценции;

    А  -  среднее  из  показаний  флюориметра  для  стандартного   раствора

     2

тиамина;

    А  - среднее  из  показаний  флюориметра  для контроля на реактивы;

     3

    V  - объем испытуемого раствора (куб. см), взятый для окисления тиамина

     1

в тиохром;

    а - навеска (г);

    10 - коэффициент пересчета из мкг/г в мг/100 г продукта.