Утверждены

Минздравом СССР

14 июля 1988 г. N 4657-88

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИЗОФЕНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА ДИНОСЕБА

В СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРОДУКЦИИ (ОГУРЦЫ, ТОМАТЫ,

АПЕЛЬСИНЫ, ЯБЛОКИ, ГРУШИ, САХАРНАЯ СВЕКЛА) В ВОДЕ

И ПОЧВЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ <*>

 

--------------------------------

<*> Разработаны Ф.Р. Мельцер, К.Ф. Новиковой, Т.В. Алдошиной, Л.И. Лещинской, И.Л. Меерзон (ВНИИХСЗР) с использованием разработок коллективов ВНИИГИНТОКС (М.А. Клисенко, В.Д. Чмиль, А.М. Шмигидина, С.В. Чулкова, З.А. Лейка, С.Л. Акоронко), ВИЗР (Т.М. Петрова).

 

Дополнение к N 2474-81 от 22.10.81.

Краткая характеристика препарата приведена в Методических указаниях N 4709-88.

МДУ изофена в огурцах, томатах, перце, яблоках, грушах, цитрусовых, хлопковом масле, винограде, сахарной свекле - 0,05 мг/кг; в малине, смородине, крыжовнике содержание изофена не допускается. ПДК в кормах 0,5 мг/кг, в почве - 1 мг/кг, в водоемах санитарно-бытового водопользования - 0,2 мг/л. Не допускается в водоемах рыбохозяйственного назначения.

Принцип метода. Метод основан на извлечении изофена и диносеба из подкисленного анализируемого объекта органическим растворителем. После удаления растворителя сухой остаток растворяют в гексане и отделяют диносеб экстракцией 0,5 н раствором гидроксида натрия. При анализе томатов гексановую фракцию, содержащую изофен, очищают микросублимацией в вакууме, а при анализе остальных объектов - хроматографией на колонке с оксидом алюминия; определяют методом ГЖХ или ТСХ.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 60.

 

Таблица 60

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ТСХ

 

┌──────────┬───────┬────────────┬───────────┬───────────┬─────────────────┐

│Анализи-  │Предел │   Нижний   │  Среднее  │Стандартное│  Доверительный  │

│руемый    │обнару-│   предел   │ значение  │отклонение │интервал среднего│

│объект    │жения, │определения,│определения│при n = 15,│ определения при │

│          │мкг    │мг/кг, мг/л │при n = 15,│     %     │n = 5, p = 0,95, │

│          │       │            │     %     │           │       %         │

├──────────┴───────┴────────────┴───────────┴───────────┴─────────────────┤

│                                Изофен                                   │

│                                                                         │

│Огурцы    │0,5    │0,01        │80 +/- 8   │+/- 8      │+/- 10           │

│Томаты    │0,5    │0,01        │81 +/- 7   │+/- 7      │+/- 10           │

│Яблоки    │0,5    │0,01        │79 +/- 6   │+/- 6      │+/- 8            │

│Груши     │0,5    │0,01        │80 +/- 7   │+/- 7      │+/- 9            │

│Апельсины │0,5    │0,02        │72 +/- 4   │+/- 4      │+/- 5            │

│Сахарная  │0,5    │0,01        │83 +/- 9   │+/- 9      │+/- 13           │

│свекла    │       │            │           │           │                 │

│Почва     │0,5    │0,05        │79 +/- 8   │+/- 8      │+/- 11           │

│Вода      │0,5    │0,001       │79 +/- 7   │+/- 7      │+/- 10           │

│                                                                         │

│                                Диносеб                                  │

│                                                                         │

│Огурцы    │0,2    │0,004       │88 +/- 8   │+/- 8      │+/- 11           │

│Томаты    │0,2    │0,004       │81 +/- 8   │+/- 8      │+/- 11           │

│Яблоки    │0,2    │0,004       │79 +/- 9   │+/- 9      │+/- 13           │

│Груши     │0,2    │0,004       │88 +/- 7   │+/- 7      │+/- 10           │

│Апельсины │0,2    │0,008       │84 +/- 6   │+/- 6      │+/- 8            │

│Сахарная  │0,2    │0,004       │87 +/- 8   │+/- 8      │+/- 11           │

│свекла    │       │            │           │           │                 │

│Почва     │0,2    │0,02        │84 +/- 9   │+/- 9      │+/- 12           │

│Вода      │0,2    │0,0004      │88 +/- 7   │+/- 7      │+/- 10           │

└──────────┴───────┴────────────┴───────────┴───────────┴─────────────────┘

 

Избирательность метода. Метод селективен. Прочие пестициды определению не мешают. Избирательность метода обеспечивается сочетанием методов (ТСХ и ГЖХ), систем подвижных растворителей и проявляющих реагентов при ТСХ.

Реактивы и растворы. Ацетон х.ч. Хлороформ ч.д.а. Бензол ч.д.а., свежеперегнанный. Гексан ч.д.а., свежеперегнанный. Этил-ацетат х.ч. Спирт этиловый ректиф. Уксусная кислота ч.д.а., ледяная. н-Гептан эталонный. Серная кислота особой чистоты, концентрированная. Сульфат натрия безводный х.ч. Хлороводородная кислота особой чистоты, концентрированная, 2 н, 0,1 н растворы. Гидроксид натрия х.ч., 0,5 н раствор. Гидроксид калия ч., 6-процентный раствор в этиловом спирте. Хлорид натрия х.ч. Оксид алюминия II степени активности по Брокману, нейтральный, для хроматографии. Цинковая пыль ч.д.а., суспензия в ацетоне (5 г цинка на 100 мл ацетона). Нингидрин ч.д.а., 0,25-процентный раствор в этиловом спирте.

Проявляющие реагенты:

N 1 - 6-процентный раствор KOH в этиловом спирте;

N 2 - перед использованием смешивают 10 мл 0,25-процентного раствора нингидрина с 1 мл ледяной уксусной кислоты.

Хроматон N-супер с 3% SE-30 (0,16 - 0,20 мм), готовый товарный носитель фирмы "Хемапол". Хроматон N-супер с 3% OV-17 (0,16 - 0,20 мм), готовый товарный носитель фирмы "Хемапол" (Чехословакия). Газообразный азот особой чистоты из баллона. Пластинки "Силуфол". Стандартные растворы изофена и диносеба в гексане с содержанием 100 мкг/мл (раствор N 1) и 10 мкг/мл (раствор N 2). Стандартные растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 мес.

Приборы и посуда. Хроматограф "Цвет-106" или аналогичный прибор с ДЭЗ. Хроматографические колонки стеклянные длиной 100 см с внутренним диаметром 3 мм. Хроматографические камеры с пришлифованными крышками. Ротационный вакуумный испаритель или аналогичный прибор. Стеклянная хроматографическая колонка с краном и оттянутым носиком длиной 10 см с внутренним диаметром 1 см. Делительные воронки вместимостью 1000 и 100 мл. Вакуумный микросублиматор. Масляный насос с манометром (для создания вакуума). Колбы: плоскодонные вместимостью 500 и 250 мл; круглодонные вместимостью 500 и 50 мл; грушевидные вместимостью 50 мл; мерные вместимостью 100 мл. Мерные цилиндры на 1000 и 100 мл. Пипетки на 10 и 1 мл с делениями. Пульверизаторы стеклянные. Почвенное сито.

Подготовка к определению. Хроматографические камеры заполняют системой подвижных растворителей гексан-ацетон (4:1), н-гептан-этилацетат (4:1) или гексан-ацетон-ледяная уксусная кислота (20:5:1) за 1 ч до начала хроматографирования. Объем подвижного растворителя в камере не должен превышать уровень дна более чем на 0,7 - 1,0 см.

В стеклянную хроматографическую колонку помещают ватный тампон, затем суспензию оксида алюминия в гексане (при открытом кране колонки). Когда сорбент заполнит всю колонку, дают стечь избытку растворителя, оставляя слой не более 0,2 - 0,3 см над поверхностью оксида алюминия. Кран закрывают.

Подготовка проб к анализу. Для анализа огурцов, томатов, яблок, груш, свеклы из отдельных вымытых плодов или корнеплодов средней пробы ножом вырезают секторы толщиной 2 - 3 мм и измельчают на мелкие кусочки. Подготавливают 3 - 5 параллельных навесок массой 50 г (навески апельсинов по 25 г). Почву просеивают через почвенное сито и отбирают навески массой 10 г.

Ход анализа. Экстракция. Навеску анализируемой пробы огурцов, томатов, яблок, груш, апельсинов (50 г) помещают в плоскодонную колбу на 500 мл, добавляют 0,5 мл 2 н HCl и с помощью механического встряхивания колбы в течение 30 мин. экстрагируют изофен и диносеб этилацетатом трижды порциями по 100 мл. Если в экстракте отчетливо наблюдается водный слой, при декантировании раствора избегают сливания водной фазы. Перед последней декантацией экстракта в колбу с анализируемым образцом добавляют 5 - 10 г безводного сульфата натрия для связывания избытка воды.

Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (10 - 15 г), фильтруют в круглодонную колбу, а затем с помощью ротационного вакуумного испарителя отгоняют растворитель до объема 1 - 2 мл. Остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл и трижды смывают стенки колбы гексаном порциями по 5 - 10 мл. Из объединенного гексанового раствора отделяют диносеб тройной реэкстракцией 0,5 н NaOH порциями по 10 мл. Изофен остается в гексане. Далее определение изофена и диносеба проводят раздельно.

Навеску анализируемого образца свеклы (50 г) помещают в плоскодонную колбу на 500 мл, добавляют 5 мл 0,1 н HCl и с помощью механического встряхивания колбы в течение 30 мин. трижды экстрагируют изофен и диносеб смесью гексана с ацетоном (4:1) порциями по 100 мл. Объединенный экстракт концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл гексана. Полученный раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл, трижды смывая стенки колбы гексаном порциями по 5 - 10 мл. Из полученного раствора отделяют диносеб реэкстракцией NaOH, как при экстракции из овощей и фруктов.

Навеску почвы (10 г) растирают в фарфоровой ступке, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл, тщательно смачивают 10 мл 0,1 н HCl и с помощью механического встряхивания колбы в течение 30 мин. экстрагируют изофен и диносеб смесью гексана с ацетоном (4:1) порциями по 75 мл. Если почва очень влажная (в экстракте отчетливо наблюдается водный слой), при декантировании органического слоя избегают сливания водной фазы. Перед последней декантацией экстракта в колбу с почвой добавляют около 5 г безводного сульфата натрия для связывания избытка воды. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (20 г), фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу на 500 мл, остаток сульфата натрия в колбе и фильтр несколько раз промывают смесью гексана с ацетоном (общий объем 10 мл) и с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. Сухой остаток растворяют в 5 мл гексана и полученный раствор количественно с помощью 15 мл гексана переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл. Из объединенного гексанового раствора отделяют диносеб реэкстракцией NaOH, как при экстракции из овощей и фруктов.

Исследуемый образец воды (500 мл) помещают в делительную воронку на 1 л, добавляют 1 - 2 мл 0,1 н HCl (до pH 3), 5 г NaCl и 100 мл хлороформа. Смесь энергично встряхивают в течение нескольких минут. После разделения слоев нижний (хлороформный) слой сливают в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл. Экстракцию изофена и диносеба проводят еще дважды тем же количеством хлороформа. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (10 - 15 г), порциями фильтруют в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Каждую порцию фильтрата концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема примерно 0,05 мл. Далее проводят определение изофена и диносеба методом ТСХ. При определении изофена методом ГЖХ последнюю порцию растворителя удаляют полностью.

Если сконцентрированный экстракт грязный, то последнюю порцию (1 - 2 мл) количественно переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл гексаном (общий объем 15 - 20 мл), отделяют диносеб реэкстракцией NaOH, как при экстракции из огурцов, и проводят определение изофена и диносеба раздельно.

    Очистка  экстрактов,  содержащих  изофен.  Для  очистки  экстрактов  из

огурцов,   яблок,  груш,  сахарной  свеклы,  апельсинов,  почвы  гексановую

фракцию,  содержащую изофен, несколько раз промывают дистиллированной водой

(до  нейтральной  реакции  промывных  вод)  и сушат над безводным сульфатом

натрия (2 - 3 г). Затем фильтруют через бумажный фильтр в грушевидную колбу

вместимостью   50   мл  и  концентрируют  раствор  с  помощью  ротационного

вакуумного  испарителя  до  объема  примерно  1  мл.  Остаток  переносят на

подготовленную  хроматографическую  колонку с Al O . Стенки колбы тщательно

                                                2 3

обмывают  гексаном порциями по 2 - 3 мл (общим объемом 30 - 40 мл) и каждую

порцию переносят на колонку при открытом кране, после прохождения через нее

очередной  порции  растворителя.  Нельзя  допускать  осушения  колонки! Над

сорбентом  всегда должен оставаться небольшой слой растворителя! Гексановый

элюат  отбрасывают  и  элюируют  изофен  из  колонки  40 мл смеси гексана с

бензолом  (4:1)  со  скоростью  1  капля  в  секунду  в  грушевидную  колбу

вместимостью 50 мл. Из элюата с помощью ротационного вакуумного  испарителя

отгоняют растворитель полностью при определении  методом ГЖХ или до  объема

примерно 0,05 мл при определении методом ТСХ.

Для почв с большим содержанием гумуса (тепличных) проводят дополнительную очистку. Сухой остаток, полученный после полного удаления растворителя из элюата, несколько раз тщательно смывают в делительную воронку на 100 мл смесью ацетона с водой (1:4) порциями по 5 мл (общим объемом 25 - 30 мл) и трижды экстрагируют изофен хлороформом порциями по 10 мл. Хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (5 г), фильтруют в грушевидную колбу вместимостью 50 мл и концентрируют раствор с помощью ротационного вакуумного испарителя досуха при определении методом ГЖХ или до объема около 0,05 мл при определении методом ТСХ.

Гексановый экстракт из томатов, содержащий изофен, концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 1 - 2 мл. Остаток количественно с помощью гексана переносят в патрон сублиматора (см. рис. 1 - не приводится). Патрон помещают на горячую водяную баню и полностью удаляют растворитель, регулируя равномерное распределение остатка по дну сублиматора. В патрон помещают "палец" сублиматора и проводят сублимацию изофена на кипящей водяной бане в течение 45 мин. при давлении 13,3 - 40 Па (0,1 - 0,3 мм рт. ст.). После окончания сублимации изофен смывают с "пальца" сублиматора в грушевидную колбу вместимостью 50 мл с помощью 20 мл ацетона. Раствор концентрируют на вакуумном испарителе досуха при определении методом ГЖХ или до объема около 0,05 мл при определении методом ТСХ.

Очистка экстрактов, содержащих диносеб. Щелочной экстракт, содержащий диносеб, переносят в делительную воронку на 100 мл, подкисляют 1,5 мл концентрированной HCl (до pH 3) и трижды экстрагируют диносеб хлороформом порциями по 10 мл. Объединенный хлороформный экстракт переносят в делительную воронку на 100 мл и проводят очистку двойной обработкой концентрированной серной кислотой порциями по 10 мл. Хлороформный слой несколько раз промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (200 мл), затем сушат его над безводным сульфатом натрия (5 г), фильтруют в грушевидную колбу на 50 мл, а затем концентрируют раствор с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема примерно 0,05 мл. Далее диносеб определяют методом ТСХ.

    Условия  хроматографирования  при  определении  изофена   методом  ГЖХ.

Хроматограф "Цвет-106" с ДЭЗ. Насадка колонки 3% SE-30 на хроматоне N-супер

(0,16  -  0,20  мм)  или  3%  OV-17  на том же носителе. Длина колонки 1 м,

                                                            -12

внутренний диаметр 3 мм. Рабочая шкала электрометра 20 x 10    А. Скорость

протяжки  ленты  самописца 240 мм/ч. Скорость потока азота (мл/мин.): через

колонку  -  50,  через  детектор  -  150.  Температура (°C): колонки - 200,

испарителя - 230, детектора - 230. Линейный диапазон определения 3 - 30 нг.

Время удерживания изофена 3 мин. 25 с на SE-30 и 4 мин. 13 с на OV-17.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки по высоте пиков с использованием градуировочного графика. Для построения градуировочного графика в хроматограф в трехкратной повторности вводят до 3 мкл стандартных растворов изофена с содержанием 1; 3; 5; 8 и 10 мкг/мл (нг/мкл). Строят график зависимости высоты пика (в мм) от концентрации изофена (в нг). Серию стандартных растворов для построения графика готовят следующим образом: в 4 градуированные пробирки вместимостью 10 мл с пробками на шлифе пипеткой вносят 1; 3; 5 и 8 мл стандартного раствора N 2 и доводят объем до 10 мл гексаном. Пробирки держат плотно закрытыми.

Определение изофена и диносеба методом ТСХ. Для определения изофена и диносеба сконцентрированные до 0,05 мл экстракты количественно при помощи стеклянного капилляра переносят на пластинку "Силуфол". Справа и слева от рабочей пробы наносят серию стандартных растворов изофена и диносеба с содержанием первого 0,5; 1; 2; 3 мкг, второго - 0,2; 0,3; ...; 2 мкг. Растворы готовят следующим образом: из стандартного раствора N 2 изофена или диносеба с содержанием 10 мкг/мл микрошприцем на 100 мкл или микропипеткой на 0,1 мл вносят соответственно 50; 100; 200; 300 мкл изофена или 20; 30; 50; ...; 200 мкл диносеба и концентрируют растворы на горячей водяной бане до объема примерно 0,05 мл.

    Пластинку   помещают   в   хроматографическую   камеру    и   развивают

хроматограммы  в  одной  из  систем  подвижных  растворителей гексан-ацетон

(4:1), н-гептан-этилацетат (4:1) или гексан-ацетон-ледяная уксусная кислота

(20:5:1).  Для  почвы  с большим содержанием гумуса рекомендуется последняя

система.  Эта  система - основная,  первые   две  - альтернативные.   После

окончания хроматографирования  пластинку  сушат  на  воздухе  (в  последнем

случае  до  полного  испарения  уксусной  кислоты),  а  затем  обрабатывают

проявляющим реагентом. При  проявлении  пластинок проявляющим раствором N 1

(6-процентный КОН в  этиловом  спирте)  диносеб проявляется сразу же в виде

желтых  пятен на белом фоне с величиной R   0,65 +/- 0,05 в первой системе,

                                         f

0,60 +/- 0,05 - во второй и 0,74 +/- 0,05 - в третьей. Изофен на пластинках

проявляется после нагревания хроматограмм в сушильном шкафу при температуре

80 - 90 °C  в течение  5 - 7 мин. в  виде желтых  пятен  на белом фоне с R

                                                                          f

соответственно  0,62  +/-  0,05;  0,50  +/- 0,05 и 0,53 +/- 0,05  в первой,

второй  и третьей системе  растворителей.  В  системе   гексан-ацетон (4:1)

изофен   и   диносеб    практически    не    разделяются,    поэтому    при

хроматографировании  экстрактов из воды,  не прошедших очистку, эту систему

использовать нельзя.

При проявлении хроматограмм проявляющим реагентом N 2 высушенные хроматограммы сначала обрабатывают из пульверизатора суспензией цинковой пыли в ацетоне, а затем нингидриновым проявителем. Изофен после пятиминутного нагревания пластин в сушильном шкафу при температуре 100 °C проявляется в виде фиолетово-малиновых пятен на белом фоне с линейным диапазоном определения от 0,3 до 3 мкг. Пятна стабильны в течение 5 - 6 мин., затем они становятся серыми. Диносеб в этих условиях проявляется в виде серых пятен на белом фоне с линейным диапазоном определения от 0,5 до 5 мкг. Пятна стабильны.

Обработка результатов анализа. При определении методом ГЖХ содержание изофена в анализируемой пробе (X, мг/кг, мг/л) вычисляют по формуле:

 

                                      AV

                                        2

                                  X = ---,

                                      V P

                                       1

 

    где:

    A  -  количество  изофена,  найденное  в  хроматографируемой  пробе, по

градуировочному графику, нг;

    V  - общий объем рабочего раствора, мл;

     2

    V  - объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл;

     1

    P - навеска анализируемого образца или объем пробы воды, г, мл.

Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит зашкаливание, к рабочему раствору пипеткой добавляют известное количество гексана и анализируют более разбавленные растворы.

При использовании метода ТСХ количественное определение изофена или диносеба в пробе проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартных растворов. При большом содержании изофена или диносеба конечный раствор концентрируют досуха и пипеткой добавляют известное количество гексана. На пластинку наносят аликвотную часть раствора.

Содержание изофена или диносеба в анализируемой пробе (X, мг/кг, мг/л) вычисляют по формуле:

 

                                     AV

                                       2

                                 X = ---,

                                     V P

                                      1

 

    где:

    A  -  количество  изофена  или диносеба, найденное в хроматографируемой

пробе, мкг;

    V  - общий объем рабочего раствора, мл;

     2

    V   -  объем  аликвоты,  нанесенной на хроматографическую пластинку, мл

     1

(при нанесении всей пробы V  = V );

                           1    2

    P - навеска анализируемой пробы или объем анализируемой воды, г, мл.

Требования безопасности. Следует соблюдать правила безопасности, принятые для работы с пестицидами и легковоспламеняющимися жидкостями.