Утверждены
Минздравом СССР
14 июля 1988 г. N 4661-88
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КМП И ЕГО МЕТАБОЛИТА МП В ВОДЕ,
ПОЧВЕ, РАСТИТЕЛЬНОМ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны Ю.А. Бунятяном, М.С. Петросян (Филиал ВНИИГИНТОКС).
Препарат КМП рекомендуется для применения
в сельском хозяйстве в качестве ингибитора нитрификации азотных удобрений на
посевах риса, пшеницы, овощей, хлопчатника. МП - продукт разложения КМП.
Краткая характеристика препаратов. КМП -
1-карбамоил-3(5)-метилпиразол.
Брутто-формула C H N O.
Молекулярная масса 125,1.
Химически чистое
5 7 3
соединение -
кремоватый порошок с резким запахом,
т. пл. 127 °C. Хорошо
растворим в
ацетоне, хлороформе, этаноле,
растворимость в воде 6,5 мг/л.
При нагревании
до 180 °C, а также
при действии разбавленных кислот и
щелочей разлагается с образованием МП. КМП - среднетоксичное соединение,
ЛД для крыс составляет 1280 мг/кг. МП - 3(5)-метилпиразол. Брутто-формула
50
C H N . Молекулярная масса
82,1. Химически чистое
соединение -
4 6 2
светло-желтая жидкость
с пиридиноподобным запахом,
плотностью
1,008 мг/куб.
м при 20 °C, т. кип. 204 °C. Неограниченно
смешивается с
водой и
большинством органических
растворителей. МП - среднетоксичное
соединение,
ЛД для крыс составляет 240 мг/кг.
50
Принцип метода. Метод основан на извлечении
КМП и МП из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке экстрактов в
кислой среде, реэкстракции препаратов в щелочной
среде и хроматографическом разделении в тонком слое
пластинок "Силуфол". Зоны локализации
препарата и его метаболита обнаруживаются после предварительного облучения УФ-светом и обработки пластинок йод-крахмальным реагентом
или реагентом Паули.
Метрологическая характеристика метода
представлена в таблице 128.
Таблица 128
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА (n = 20, p
= 0,95)
┌─────────────┬──────────┬─────────────┬────────┬───────────┬─────────────┐
│Анализируемый│Предел │
Диапазон │Среднее │Стандартное│Доверительный│
│ объект
│обнаруже- │определяемых │значение│отклонение,│ интервал
│
│ │ния,
мг/кг│концентраций,│опреде- │ %
│ среднего, % │
│ │или л │ мг/кг или л │ления, %│
│ │
├─────────────┴──────────┴─────────────┴────────┴───────────┴─────────────┤
│ КМП │
│
│
│Вода │0,01 │0,01 - 0,1 │93,0 │+/- 3,07 │+/- 1,40 │
│Почва │0,04 │0,04 - 0,4 │85,0 │+/- 1,77 │+/- 0,82 │
│Рис │0,04 │0,04 - 0,4 │90,2 │+/- 3,15 │+/- 1,47 │
│Пшеница │0,04 │0,04 - 0,4 │89,6 │+/- 2,96 │+/- 1,38 │
│Кукуруза │0,04 │0,04 - 0,4 │85,0 │+/- 1,41 │+/- 0,67 │
│Томаты │0,08 │0,08 - 0,4 │85,0 │+/- 1,47 │+/- 0,82 │
│Картофель │0,08 │0,08 - 0,4 │83,0 │+/- 1,99 │+/- 1,00 │
│Биосубстраты │0,2 │0,2 - 2,0 │89,0 │+/- 2,53 │+/- 1,04 │
│
│
│ МП │
│
│
│Вода │0,01 │0,01 - 0,1 │93,0 │+/- 3,07 │+/- 1,4 │
│Почва │0,04 │0,04 - 0,4 │89,0 │+/- 1,89 │+/- 0,78 │
│Рис │0,04 │0,04 - 0,4 │91,0 │+/- 5,3 │+/- 2,19 │
│Пшеница │0,04 │0,04 - 0,4 │90,4 │+/- 4,45 │+/- 1,34 │
│Кукуруза │0,04 │0,04 - 0,4 │89,0
│+/- 2,53 │+/-
1,04 │
│Томаты │0,08 │0,08 - 0,4 │85,0 │+/- 1,77 │+/- 0,82 │
│Картофель │0,08 │0,08 - 0,4 │81,1 │+/- 1,83 │+/- 0,76 │
│Биосубстраты │0,2 │0,2 - 2,0 │85,0 │+/- 1,77 │+/- 0,82 │
└─────────────┴──────────┴─────────────┴────────┴───────────┴─────────────┘
Избирательность метода. В предлагаемых
условиях хроматографирования метод специфичен в
присутствии близких по структуре и области применения таких соединений, как нитрапирин, 6-хлорпиколиновая кислота, ХГИ, ТМДИ, ГМДИ,
АТГ, а также применяющихся на посевах риса - пропанид,
базагран.
Реактивы
и материалы. КМП х.ч. МП х.ч. Хлороформ х.ч. н-Гексан х.ч.
Этиловый спирт х.ч. Хлороводородная кислота концентрированная х.ч., 1 н.
Безводный сульфат
натрия ч. Ацетон
х.ч.
Натрия гидроксид х.ч.,
20-процентный.
Гидроксид калия х.ч.,
10-процентный. Нитрит натрия
х.ч.,
10-процентный. Кислота
сульфаниловая безводная, ч.д.а. Калий
марганцовокислый
х.ч.,
3-процентный. Йодид калия х.ч., 1-процентный в.р.
Крахмал
водорастворимый х.ч.,
3-процентный. Фильтры бумажные обеззоленные
"синяя
лента", предварительно промытые смесью хлороформ-ацетон (1:1).
Пластинки хроматографические "Силуфол" УФ
размером 15 x 15 см.
254
Стандартные растворы
КМП и МП, содержащие 1; 10 и 100
мкг/мл. Хранить в
холодильнике не более 3 мес.
Проявляющие реагенты: N 1 - сульфаниловая
кислота диазотированная (реагент Паули).
Приготовление соли диазония: 5 г сульфаниловой
кислоты растворяют в 25 мл 10-процентного раствора гидроксида калия.
Охлажденный раствор смешивают с 25 мл 10-процентного раствора нитрита натрия.
Этот раствор по каплям при перемешивании прибавляют к охлажденной льдом хлороводородной кислоте (40 мл хлороводородной
кислоты + 20 мл дистиллированной воды). Выпавший осадок отмывают на воронке Бюхнера спиртом и сушат на фильтре. При хранении в
холодильнике в темной склянке соль устойчива 3 мес. Для опрыскивания готовят
рабочий раствор - 1,5-процентный раствор диазониевой
соли в 15-процентном растворе гидроксида натрия. Раствор готовят перед
употреблением в количествах, необходимых для разового пользования; N 2 - йод-крахмальные реагенты: а - 1-процентный раствор йодида
калия; б - 3-процентный раствор крахмала. Перед употреблением смешать растворы
а, б и этанол в соотношении 2,5:2,5:1. Раствор для
хлорирования. Смешивают равные объемы 3-процентного раствора перманганата калия
и 25-процентного раствора хлороводородной кислоты.
Готовят перед употреблением в количествах, необходимых для разового
пользования.
Приборы, аппаратура, посуда.
Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Ротационный вакуумный испаритель.
Колбы: мерные на 100 мл; конические на 100 и 250 мл; круглодонные на 100 мл.
Воронки делительные и химические. Микропипетки на 0,1 и 0,2 мл. Цилиндры мерные
на 50 и 100 мл. Камера хроматографическая.
Пульверизаторы стеклянные. Камера для хлорирования (эксикатор).
Отбор проб. Отобранные пробы
анализировать сразу.
Ход анализа. Экстракция и очистка
экстрактов. Пробу воды (100 мл) помещают в коническую колбу, прибавляют
безводный сульфат натрия до насыщения и экстрагируют КМП и МП хлороформом
трижды порциями по 50; 30 и 30 мл. Объединенные экстракты фильтруют в
перегонные колбы через фильтр "синяя лента" и слой безводного
сульфата натрия (1 - 2 г) и отгоняют растворитель на ротационном испарителе при
температуре не более 30 °C до объема 0,1 - 0,2 мл. Остаток количественно с
помощью хлороформа наносят на хроматографическую
пластинку.
Навеску (25 г) измельченной и просеянной
почвы трижды экстрагируют ацетоном порциями по 50 мл. Объединенные экстракты
фильтруют через фильтр "синяя лента" и слой безводного сульфата
натрия (1 - 2 г) и отгоняют растворитель досуха на ротационном испарителе при
температуре не выше 30 °C. К сухому остатку прибавляют 10 мл 1 н раствора хлороводородной кислоты, тщательно ополаскивают колбу и
переносят в коническую колбу на 100 мл через фильтр "синяя лента".
Колбу еще дважды по 10 мл промывают 1 н раствором хлороводородной
кислоты и сливают в ту же колбу. Объединенный экстракт хлороводородной
кислоты подщелачивают 20-процентным раствором гидроксида натрия до pH 9, затем прибавляют безводный сульфат натрия до
насыщения (10 - 12 г) и экстрагируют КМП и МП хлороформом трижды по 15 - 20 мл.
Далее поступают аналогично анализу воды.
Измельченную пробу растительного
материала (рис, пшеница, кукуруза, картофель, томаты) (25 г) экстрагируют
хлороформом трижды по 50 мл. Растворитель фильтруют в перегонную колбу через
фильтр "синяя лента" и слой безводного сульфата натрия. Далее
поступают аналогично анализу почвы.
Экстракцию из
биологического материала (кровь, печень, легкие, почки, сердце, селезенка,
мозг, моча, кал) проводят следующим образом. Измельченную пробу (5 г или 5 мл) трижды экстрагируют хлороформом по
15 - 20 мл. Объединенный экстракт фильтруют в перегонную колбу через фильтр
"синяя лента" и слой безводного сульфата натрия. Далее поступают
аналогично анализу почвы.
Условия хроматографирования.
После отгонки растворителя пробы с помощью хлороформа количественно наносят на
пластинки "Силуфол" на расстоянии 1 см от
нижнего края пластинки. Справа и слева от пробы наносят стандартные растворы
КМП и МП (в одну точку), содержащие известные количества препаратов. Развитие хроматограммы проводят в системе гексан-ацетон
(5:3). После поднятия фронта растворителя на 14 см пластинку проветривают на
воздухе до полного удаления растворителей. Затем пластинку подвергают облучению
УФ-светом и течение 35 - 40 мин. и обрабатывают из
пульверизатора проявляющими реагентами N 1 или N 2.
1. Опрыскивание рабочим раствором
реагента Паули (на одну пластинку расходуется 1,5 - 2 мл реагента). Зоны
локализации КМП и МП обнаруживаются в виде красных пятен на белом фоне. Окраска
пятен МП устойчива в течение нескольких дней, КМП - 5 - 10 мин. Предел
обнаружения на пластинке составляет для КМП 2 мкг; МП - 0,5 мкг.
2. После
УФ-облучения пластинки помещают
в камеру с раствором для
хлорирования на 3 мин., оставляют пластинку на воздухе до
полного удаления
запаха хлора
(около 15 мин.)
и обрабатывают из
пульверизатора
йод-крахмальным
проявляющим реагентом. Зоны локализации обнаруживаются в
виде синих пятен на светлом фоне. Окраска пятен устойчива в
течение 3 дней.
Предел обнаружения
на пластинке составляет для КМП 0,1 мкг, для МП 1 мкг.
Величины R составляют для КМП 0,55 +/- 0,02, для МП 0,35
+/- 0,02.
f
Обработка результатов анализа.
Количественную оценку проводят путем сравнения площадей и интенсивности окраски
пятен проб и стандартных растворов. Содержание КМП и МП в анализируемой пробе
(X, мг/кг или л) определяют по формуле:
A
X = -,
P
где:
A - количество КМП, МП, найденное путем
сравнения со стандартами, мкг;
P - навеска или объем анализируемой
пробы, г или мл.
Требования безопасности. Соблюдать все
необходимые требования безопасности при работе в химических лабораториях.