Утверждаю

Заместитель начальника

Главного эпидемиологического

управления Минздрава СССР

Г.Г.ОНИЩЕНКО

21 ноября 1989 г. N 15-6/28

 

ИНСТРУКЦИЯ

ПО КЛИНИЧЕСКОЙ И ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА

 

Учреждения-разработчики: ЦНИИ эпидемиологии МЗ СССР (Москва), Ленинградский ордена Трудового Красного Знамени НИИЭиМ им. Пастера МЗ РСФСР, МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва).

В Инструкции нашли отражение результаты исследований, проведенных совместно со специалистами Института гигиены и эпидемиологии Минздрава ЧСР, Прага (Е. Шрамова, Е. Альдова, Г. Лготова) и Региональной санэпидстанции ЧСР, Чешские Будейовицы (О. Гаузнер).

Для врачей инфекционных отделений и бактериологических лабораторий больниц, санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских институтов.

 

1. Введение

 

По данным специальной литературы, микроорганизмы рода Campylobacter (кампилобактер) в качестве этиологического фактора острых кишечных заболеваний (ОКЗ) встречаются не реже чем сальмонеллы, шигеллы и ротавирусы и вызывают - в зависимости от сезона и особенностей региона - от 3 до 15 проц. ОКЗ.

В инфекционной патологии человека и животных важнейшую роль играют виды C. jejuni, C. coli и C. bariolis, вызывающие ОКЗ сходного клинического течения (кампилобактериоз) и на основании своей способности к росту при относительно высокой температуре инкубации объединенные в группу термофильных кампилобактеров. Среди прочих - мезофильных, предпочитающих умеренную температуру инкубации - видов кампилобактера известную роль в патологии человека играют C. fetus, зачастую являющийся возбудителем артритов, менингитов, васкулитов, и C. pilori, ассоциирующийся с эрозивно-язвенными поражениями желудка и двенадцатиперстной кишки; виды C. consisus и C. futorum расцениваются как комменсалы полости рта, возможно, играющие роль в патогенезе пародонтита, а виды <...> и <...> встречаются в толстом кишечнике человека при иммунодефицитных состояниях той или иной природы.

Термофильные кампилобактеры обнаружены практически у всех изученных видов диких и домашних животных, многие из которых являются его естественными резервуарами. Основным резервуаром кампилобактера следует считать сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиней, кур), дополнительными - больных людей и домашних животных, диких городских птиц и грызунов. Основным путем передачи возбудителя инфекции является пищевой (сырое молоко, битая птица; в меньшей степени - говядина, свинина), дополнительными - водный (речная и морская вода, загрязненная испражнениями животных) и бытовой (несоблюдение санитарно-гигиенических правил при уходе за больными людьми и животными, а также при кулинарной обработке мясных продуктов) пути передачи. Кампилобактериозу свойственна выраженная летняя сезонность с почти полным отсутствием заболеваемости в зимние месяцы года; чаще заболеваемость регистрируется в виде спорадических случаев, изредка - в виде более или менее крупных вспышек. Следует признать, что эпидемиологические особенности кампилобактериоза в СССР изучены недостаточно, и лишь безотлагательное внедрение в широкую практику методов лабораторной диагностики кампилобактериоза может способствовать прогрессу в изучении эпидемиологического аспекта этой комплексной проблемы, чрезвычайно актуальной для практического здравоохранения.

Настоящая Инструкция по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза предназначена для врачей-инфекционистов и врачей-бактериологов поликлиник, больниц и санитарно-эпидемиологических станций, а также для сотрудников профильных лабораторий научно-исследовательских институтов.

 

2. Клинические проявления кампилобактериоза

 

Как это было отмечено выше (раздел 1), кампилобактериоз - острое инфекционное кишечное заболевание зоонозной природы, вызываемое термофильными кампилобактерами.

2.1. Кампилобактериоз у детей:

Кампилобактериозом болеют дети всех возрастных групп (чаще - в возрасте 1 - 3 лет) со средней частотой 6,7 процента от общего числа госпитализированных по поводу ОКЗ; периоды сезонного подъема заболеваемости этой инфекцией совпадают у всех возрастных групп.

Инкубационный период при кампилобактериозе составляет 1 - 3, изредка - 5 дней.

Диарея является кардинальным и, чаще всего, начальным симптомом болезни, редко сохраняющимся дольше 1 - 2 недель. Частота стула у большинства заболевших не превышает 7 - 10 раз в сутки, лишь у отдельных больных достигает 20 и более раз.

Стул - обильный, жидкий, зелено-бурый, с примесью слизи и зелени, а у половины больных - начиная с 1 - 3 дня болезни - и крови; зачастую отмечается синдром "водянистой диареи". Из прочих симптомов поражения желудочно-кишечного тракта наиболее часто отмечаются урчание и плеск по ходу толстой кишки; спазм сигмовидной кишки отмечается весьма редко, тенезмы не отмечаются вовсе.

Боли в животе, возникающие как в первый день болезни, так и в более поздние сроки, и являющиеся вторым ведущим симптомом кампилобактериоза, локализуются, как правило, вокруг пупка и в правой подвздошной области, реже - носят разлитой характер. У детей первого года жизни боли в животе проявляются выраженным беспокойством, криком, сучением ножками, реакцией на пальпацию живота. Боли при кампилобактериозе отличаются постоянством и усиливающейся интенсивностью при движении, иногда настолько значительной, что возникает необходимость исключения хирургической патологии брюшной полости. (В ряде случаев наблюдаются и истинные аппендициты с участием кампилобактера в их патогенезе - с развитием язвенно-некротического процесса в червеобразном отростке и слепой кишке, осложняющегося перфорацией и перитонитом.)

Симптомы интоксикации, как правило, выражены умеренно и проявляются в виде бледности кожных покровов, вялости, снижении аппетита и - изредка - адинамии. Температура тела обычно не превышает 39 °С и нормализуется к 3 - 4 дню болезни.

Рвота отмечается у половины больных с первого дня болезни и чаще бывает повторной, но кратковременной - сохраняется лишь в течение 1 - 2 дней.

Нередко, независимо от возраста детей и степени тяжести течения болезни, при кампилобактериозе наблюдается развитие паренхиматозного безжелтушного гепатита и функциональных нарушений поджелудочной железы, имеющее благоприятное течение.

Экзантемы - весьма редкий для кампилобактериоза симптом, появляющийся на 1 - 2 день болезни, нарастающий в течение 1 - 2 дней и быстро угасающий. Сыпь локализуется на лице и туловище и чаще носит пятнисто-папулезный, нежели мелкоточечный характер.

В гемограмме больных кампилобактериозом отмечается умеренный лейкоцитоз со сдвигом влево, моноцитоз, ускорение СОЭ.

В копрограмме отмечаются лишь незначительные неспецифические изменения, характер которых определяется локализацией инфекционного процесса и степенью выраженности нарушений пищеварения: при воспалительных изменениях тонкой или толстой кишки обнаруживаются лейкоциты, эритроциты, клетки десквамированного эпителия; при функциональных нарушениях пищеварения - непереваренный нейтральный жир, крахмал, мышечные волокна. Наличие в копрограмме компонентов последнего типа является показанием к исследованию функции поджелудочной железы: уровней амилазы, липазы и проч., сыворотки крови и мочи.

Кампилобактериозу у детей свойственны два варианта начала болезни - острое (83,4 проц. больных), когда все основные симптомы появляются в первые два дня болезни, и подострое, когда к одному-двум симптомам, чаще болям в животе и симптомам интоксикации, на 2 - 3 день болезни присоединяются прочие: понос, рвота, лихорадка.

Клинические проявления зависят от возраста заболевшего. Острое начало характерно для большинства детей раннего возраста, когда заболевание, начавшись с появления диареи, протекает по типу энтероколита (гемоколита), реже - энтероколита, с нормализацией стула на 2 неделе болезни; присоединяющаяся в редких случаях рвота, как правило, непродолжительна, кишечные симптомы сочетаются с увеличением печени, умеренными проявлениями интоксикации и эксикоза 1 - 2 степени и нормальной, изредка - субфебрильной, температурой. У детей старше года кампилобактериоз протекает в двух клинических вариантах. Первый, наиболее часто встречающийся вариант течения, напоминает течение пищевой токсикоинфекции с острым началом, повышением температуры до фебрильных значений, появлением рвоты, нередко повторной, симптомов интоксикации (головная боль, слабость, снижение аппетита, расстройство гемодинамики), болей в животе. В ряде случаев на этой стадии развитие инфекционного процесса завершается, но у двух третей больных к концу первых - началу вторых суток развивается энтерит, реже - энтероколит с диарейным синдромом. Второму варианту течения кампилобактериоза у детей старше 1 года, встречающемуся в трети случаев, свойственно развитие энтерита и энтероколита на фоне умеренной лихорадки, умеренно выраженных симптомов интоксикации в сочетании с развитием выраженной кишечной дисфункции.

Тяжесть течения кампилобактериоза у детей определяется выраженностью кишечного синдрома и - в меньшей степени - уровнем общей интоксикации: у большинства детей отмечается легкое или среднетяжелое течение заболевания.

Рациональная антибиотикотерапия больных кампилобактериозом детей опирается на применение, в первую очередь, эритромицина, а также аминогликозидов; целенаправленная терапия с учетом возраста заболевшего и степени тяжести течения болезни приводит к укорочению срока течения болезни.

Дети с подозрением на наличие у них кампилобактериоза подлежат госпитализации в инфекционные отделения лечебных учреждений.

Кампилобактериозу у детей свойственно рецидивирующее течение - рецидивы наблюдаются у 12,1 процента реконвалесцентов на 10 - 23 день от начала заболевания, причем у трети детей они протекают тяжелее основного заболевания, и во всех случаях возникновения рецидива диарея остается ведущим его симптомом. Следует отметить, что вероятность возникновения рецидива не определяется ни степенью тяжести течения начального периода болезни, ни возрастом заболевшего.

Реконвалесцентам кампилобактериоза показано диспансерное наблюдение в течение 1 месяца, а при подозрении на возникновение рецидива - повторное обследование и госпитализация.

2.2. Кампилобактериоз у взрослых:

Как и у детей, кампилобактериоз встречается у взрослых достаточно часто - в среднем в 6,5 проц. случаев от общего числа ОКЗ, причем чаще - у лиц до 35 лет, с летне-осенним подъемом уровня заболеваемости.

Инкубационный период составляет 2 - 5, изредка - 10 дней.

Кампилобактериоз у взрослых может протекать в форме гастроэнтерита, гастроэнтероколита, но чаще в 80 проц. случаев - в форме энтероколита; в большинстве случаев кампилобактериоз протекает в легкой или среднетяжелой формах длительностью не более 1 - 2 недель.

В отличие от детей, кампилобактериозу взрослых более свойственно подострое начало с возникновением симптомов интоксикации, лихорадки, повышением температуры не более чем до 39 °С с нормализацией ее ко 2 - 4 дню; изредка в течение 1 - 2 суток отмечается рвота. Диарея и боли в животе, как правило, возникают одновременно на 2 - 3 день болезни, и длительность их обычно не превышает 5 - 8 дней, хотя изредка болевой синдром сохраняется до 2 недель при исчезновении диареи в упомянутые выше сроки. Частота дефекации колеблется от 5 - 10 до 15 - 20 раз в сутки, обычно без патологических примесей, но к концу 1 - началу 2 суток приобретает характер "ректального плевка", зачастую появляется примесь крови и отмечается синдром "водянистой диареи". Боли в животе имеют различную остроту и могут носить как диффузный характер, так и локализоваться в правой подвздошной области. Развитие выраженной дегидратации при кампилобактериозе отмечается редко, и чаще - при гастроэнтероколитическом варианте течения.

Гемограммам больных кампилобактериозом взрослых свойственен умеренный лейкоцитоз, незначительный палочкоядерный сдвиг; копрограммам - те же изменения, что и у больных кампилобактериозом детей.

При фиброколоноскопии у больных кампилобактериозом наблюдается картина геморрагического колита: на всем протяжении отечной, гиперемированной слизистой толстого кишечника встречаются множественные мелкие геморрагии до 1 - 2 мм в диаметре, изредка - более крупного размера и сливного характера. Гораздо реже, как правило, в случаях легкого течения заболевания, изменения слизистой носят катаральный характер; еще реже, в случаях тяжелого течения, отмечаются эрозивные и язвенные поражения. Изменения описанного типа, как и повышенная контактная кровоточивость слизистой вследствие стазового полнокровия ее, прослеживаются в течение 2 - 3 недель от начала заболевания.

В отличие от кампилобактериоза у детей, кампилобактериозу у взрослых не свойственны рецидивы, но в редких случаях возникают реактивные артриты, менингиты, холециститы - как правило, у лиц, страдающих иммунными дефицитами той или иной природы.

Больные с подозрением на кампилобактериоз подлежат госпитализации в инфекционные отделения лечебных учреждений, реконвалесцентам показано диспансерное наблюдение в течение 1 месяца с момента выписки из стационара.

Препаратом выбора в лечении кампилобактериоза взрослых является эритромицин; в зависимости от степени выраженности интоксикации может быть назначена патогенетическая дезинтоксикационная терапия.

При исследовании спорадических случаев или вспышек кампилобактериоза у детей и взрослых тактика врача-эпидемиолога не отличается от таковой при сальмонеллезе.

 

3. Краткая характеристика термофильных кампилобактеров

 

Согласно "Руководству по систематической бактериологии Берри" (1984), бактерии рода Campylobacter - грамнегативные, спирально изогнутые вокруг длинной оси извитые формы длиной 0,5 - 8,0 мкм и шириной 0,2 - 0,5 мкм, существующие как в виде одиночных, так и попарно расположенных, не разошедшихся после деления клеток, напоминающих в последнем случае "крылья чайки". Описанные морфологические признаки свойственны лишь бактериальным клеткам природных субстратов и молодых культур, тогда как стареющим культурам свойственно наличие кокковых и гиперспирализованных форм, количество которых в культуре пропорционально возрасту ее. Все описанные морфологические варианты кампилобактера легко окрашиваются фуксином, азур-эозином, кристаллическим фиолетовым; в то же время, в природных субстратах, главным образом, фекалиях, клетки кампилобактеров обычно плохо окрашиваются по Граму. Кампилобактеры не образуют спор и капсул, но обладают одним - двумя полярно расположенными жгутиками, обеспечивающими им высокую подвижность со стремительным, "штопорообразным" поступательным характером движения.

Кампилобактеры-микроаэрофилы и капнофилы, то есть бактерии, требующие для культивирования пониженного содержания кислорода и повышенного - углекислого газа; энергию кампилобактеры освобождают из аминокислот и трикарбоновых кислот, но не из углеводов, к окислению или ферменции которых они не способны. Будучи термофилами, кампилобактеры способны к росту при 37 - 44 °С, но не при 25 °С.

При комнатной и, в особенности, при пониженной температурах резистентность кампилобактера к действию факторов внешней среды весьма высока - в пищевых продуктах, водопроводной и сточных водах, молоке, моче, фекалиях он может сохранять жизнеспособность в течение 1 - 5 недель; в то же время, кампилобактер чрезвычайно чувствителен к нагреванию свыше 50 °С, действию прямого солнечного света и воздуха, высыханию, низким и высоким значениям рН окружающей среды.

На жидких питательных средах кампилобактер через 48 - 72 часа инкубации образует равномерное помутнение питательной среды с трудом ресуспендируемым, выраженным осадком; на полужидких пробирочных питательных средах в те же сроки образует зону роста в виде диска, расположенного на глубине 1 - 2 мм от поверхности питательной среды. На плотных питательных средах с кровью кампилобактер образует два типа колоний, первому из которых, встречающемуся несколько чаще, свойственна плоская форма, приближающиеся к округлым, хотя, зачастую, неправильные очертания, 2 - 8 мм в диаметре или максимальном поперечном размере, ровные края; колонии этого типа бесцветные или светло-серые, прозрачные, гомогенные (напоминают по виду капли воды), не способны к гемолизу, изредка - при длительном культивировании - приобретают серебристо-матовый оттенок поверхности, обладают невязкой консистенцией. Колонии второго типа имеют правильную округлую форму, 1 - 2 мм в диаметре, ровные края, блестящую гладкую поверхность, заметно возвышаются над поверхностью питательной среды, прозрачны, гомогенны, хотя при длительном культивировании центр их несколько уплотняется в сравнении с периферией, чаще - бесцветные, но при длительном выращивании способны к образованию желтоватого пигмента, гемолиз не вызывают, обладают невязкой консистенцией. На плотных питательных средах с бактериологическим углем кампилобактер образует плоские, правильной формы округлые колонии диаметром 1 - 3 мм, с ровными краями, белые, блестящие, полупрозрачные, гомогенные (напоминают по виду капли молока), склонные к врастанию в толщу питательной среды, невязкой консистенции.

Культуры кампилобактеров, выращенные на плотных питательных средах с кровью в течение 48 - 72 часов, способны приобретать оттенок или образовывать пигмент описанного выше типа.

Кампилобактер обладает сложным термолабильным и термостабильным антигенными комплексами. Клеточная стенка кампилобактера содержит эндотоксин, действие которого напоминает действие эндотоксина сальмонелл и иерсиний; некоторые штаммы способны продуцировать энтеротоксин, действие которого отчасти напоминает действие холерогена, а также присущий исключительно кампилобактеру цитотоксин уникального строения, воздействие которого на слизистую толстого кишечника человека приводит к изменениям дизентериеподобного характера.

 

4. Лабораторная диагностика кампилобактериоза

 

Как видно из материала раздела 2, клиническая картина при кампилобактериозе не отличается четкостью и не дает оснований для создания надежной схемы дифференциальной клинической диагностики этого заболевания. Очевидно, в подобной ситуации лабораторной диагностике по праву отводится решающая роль, определяющая последующую терапевтическую и эпидемиологическую тактику.

Основным, наиболее надежным и наилучшим образом разработанным методом лабораторной диагностики кампилобактериоза является бактериологический метод исследования; микроскопический метод исследования, дающий вследствие низкой чувствительности значительное число ложноотрицательных результатов, может расцениваться лишь в качестве ориентировочного; серологический метод исследования в диагностике кампилобактериоза находится в нашей стране в стадии разработки. Биологический метод исследования и метод кожно-аллергических проб в диагностике кампилобактериоза не применяются.

4.1. Бактериологический метод исследования:

4.1.1. Материал для бактериологического исследования

У больных ОКЗ материалом для бактериологического исследования служат образцы нативных фекалий или содержимое прямой кишки, полученное путем ректального мазка. Среди клинических симптомов кампилобактериоза "сигнальным" является симптом гемоколита - именно наличие крови в стуле является абсолютным показанием к бактериологическому исследованию фекалий на кампилобактериоз. Забор материала следует производить в возможно более ранние сроки, желательно - до начала антибиотикотерапии; далее, в течение всего периода болезни - по показаниям к бактериологическому исследованию (появление крови в стуле, усиление или рецидив диареи, начало реконвалесценции).

Предметы ухода за больными, откуда осуществляется забор образцов нативных фекалий (подкладные судна, горшки и проч.), после дезинфекционной обработки следует тщательно промывать водой, дабы предотвратить бактерицидное действие общепринятых антисептиков на кампилобактеры, высокочувствительные к любому из них. Содержимое прямой кишки может быть получено путем ректального мазка с глубины не менее 8 см, выполненного с помощью петли с внутренним диаметром 0,8 - 1,0 см, изготовленной из алюминиевой проволоки диаметром 0,3 - 0,5 см, вмонтированной хвостовой частью в резиновую пробку (N 14,5) и помещенной в биологическую пробирку для стерилизации паром под давлением в режиме автоклава при 121 °С и 1,1 атм. в течение 15 мин. При обследовании резервуаров бактериологическому исследованию подлежит материал, отобранный от заболевших или погибших животных: фекалии, фрагменты кишечника, а также образцы корма, воды, смывы с поддонов и проч.

4.1.2. Транспортировка и хранение проб

Если условия работы лечебного учреждения позволяют незамедлительно передавать отобранный исследуемый материал в лабораторию для бактериологического исследования, то применение транспортных средств не является обязательным: отобранные стерильным стеклянным инструментом или деревянным штапелем однократного применения в количестве 0,8 - 1,0 г в стерильные стеклянные флаконы образцы фекалий транспортируются в нативном состоянии; забор материала следует производить немедленно после дефекации. Допустимым является непродолжительное - не более 1 часа - хранение образцов нативных фекалий при 4 °С в условиях отделения.

При необходимости транспортировки исследуемого материала в течение времени, превышающего 1 час с момента его забора, следует применять пробирочные транспортные среды: физиологический раствор хлористого натрия (срок хранения фекалий при комнатной температуре - 3 - 5 час.), 0,1-процентную пептонную воду (3 - 48 час.), тиогликолевую среду для контроля стерильности (КС) (до 3 суток). В любую из перечисленных транспортных сред, разлитую по пробиркам в объеме 3,0 - 5,0 мл, исследуемый материал помещается в соотношении с ней 1:3 - 1:5 (об./об.). Охлаждение до 4 °С позволяет значительно удлинить сроки транспортировки образцов на транспортных средах: на физиологическом растворе - до 24 час., на 0,1-процентной пептонной воде - до 72 час., на среде КС - до 5 - 7 суток.

Ректальные мазки транспортируются только на транспортных средах наилучшим образом для этой цели служат агаризованная среда КС: здесь кампилобактер сохраняет жизнеспособность от 1 (без охлаждения) до 3 (с охлаждением) суток. Необходимо учесть, что проволочная петля, предназначенная для забора материала путем ректального мазка, изготовленная и простерилизованная, как это описано в п. 4.1.1, помещается в пробирку с транспортной средой лишь после забора материала: попадание транспортной среды на слизистую прямой кишки недопустимо!

4.1.3. Подготовка исследуемого материала и техника первичного высева

Нативные фекалии подлежат немедленному бактериологическому исследованию или - при отсутствии такой возможности - помещению в подходящую транспортную среду с последующим хранением на холоде не более 72 час. Перед посевом нативные фекалии разводятся в соотношении 1:10 стерильным физиологическим раствором или 0,1-процентной пептонной водой и тщательно эмульгируются; аналогичным образом подготавливаются к посеву образцы, доставленные на той или иной транспортной среде.

Выделение чистых культур кампилобактера может осуществляться как традиционным способом - с помощью рассева широким штрихом, так и с помощью фильтров - последний способ основан на способности кампилобактера активно проникать через поры, диаметром более 0,45 мкм, фильтров различных систем. В первом случае 0,1 мл эмульсии фекалий наносится на поверхность той или иной селективной плотной питательной среды для выделения кампилобактера - железо-эритрит - кровяного агара (ЖЭКА) или селективного эритрит-агара (см. Приложение 3) - и рассевается по ее поверхности пентагональным штрихом либо равномерно растирается стеклянным шпателем. Во втором случае могут быть использованы фильтры двух систем - мембранные и ядерные (см. Приложение 3), уложенные на поверхность либо питательной среды ЖЭКА (не содержащей селективной смеси антибиотиков!), либо питательной среды на основе эритрит-агара с бактериологическим углем, также не содержащей антибиотиков. При использовании мембранных фильтров "Владипор" N 6 с диаметром пор 0,55 - 0,65 мкм, уложенных по три на поверхность той или иной питательной среды, техника посева заключается в следующем: на поверхность каждого фильтра стерильной, тонко оттянутой в пламени горелки пипеткой Пастера наносятся 4 - 5 капель эмульсии одного и того же образца фекалий таким образом, чтобы посевной материал не затекал за края фильтра; очевидно, что на одну чашку может быть высеян материал трех исследуемых образцов. После экспозиции в течение 30 мин. при 37 °С фильтры удаляются с поверхности питательной среды, и посевы подлежат инкубации (см. раздел 4.1.4). При использовании ядерных фильтров на поверхность питательной среды того или иного состава рекомендуется укладывать две пары фильтров - с порами диаметром 0,45 и 0,55 мкм соответственно. Поверхность каждого фильтра инокулируется описанным выше способом 1 каплей материала эмульсии фекалий; очевидно, что на одну чашку может быть высеян материал одного исследуемого образца. Посевы подлежат инкубации (см. раздел 4.1.4) после экспозиции в течение 15 - 20 мин. при комнатной температуре и удаления фильтров с поверхности питательной среды. При использовании для выделения чистых культур кампилобактера фильтров обоих типов следует учитывать (главным образом, при выборе транспортной среды), что подвижность кампилобактера в значительной степени угнетается на средах с содержанием агара, превышающим 0,06 проц.

4.1.4. Инкубация посевов

Инкубация посевов осуществляется в микроаэрофильных условиях, создание которых с различной степенью эффективности может быть осуществлено различными способами.

Наиболее доступным, но наименее эффективным способом создания микроаэрофильных условий является сжигание бытовой свечи, помещенной внутрь стеклянного эксикатора с плотно притертой крышкой - содержание кислорода в этом случае составляет не менее 16 проц. и непрерывно возрастает в процессе инкубации, поскольку сколь угодно плотное притирание вручную крышки эксикатора с нанесением на нее слоя вазелина не способно полностью предотвратить газообмен сквозь герметизирующий слой. Несколько более эффективным способом создания микроаэрофильных условий является сжигание бытовой свечи в пространстве надежно герметизирующегося сборника твердых отходов СТО-10, применяющегося в санитарно-гигиенической практике. Значительно более эффективным способом создания микроаэрофильных условий является сжигание бытовой свечи в пространстве микроанаэростата М 4 (модель 752, Ленинградское производственное объединение "Красногвардеец") с одноименным откачиванием воздуха до уровня, соответствующего отметке "-0,8 атм." шкалы манометра микроанаэростата, вакуумным насосом любого типа, в качестве которого с успехом может быть использован хирургический отсасыватель ОХ-10 (Киевское производственное объединение "Медаппаратура").

Наилучшие результаты, однако, могут быть получены при использовании газовой смеси заводского изготовления, содержащей 5 проц. кислорода, 10 проц. углекислого газа, 85 проц. азота и выпускающейся в стальных баллонах емкостью 40 л под давлением 100 - 120 атм., многолетний опыт практической работы по выделению кампилобактеров из биологических субстратов и результаты экспериментального изучения его показывают, что описанный способ создания микроаэрофильных и капнофильных условий является оптимальным для удовлетворения физиологических потребностей этого микроорганизма при культивировании его invitro. Газовой смесью приведенного выше состава заполняется пространство анаэростата или вакуумного термостата, откуда предварительно откачан воздух до уровня, соответствующего отметкам "-0,9 атм." - "-1,0 атм." шкалы манометра; газовая смесь подается под давлением в пространство микроанаэростата или вакуумного термостата вплоть до возрастания давления внутри аппарата до уровня, соответствующего отметке "0" шкалы манометра. Процедура откачивания содержимого и заполнения пространства аппарата газовой смесью повторяется дважды, лишь при таком условии гарантируется достижение оптимального для кампилобактера состава атмосферы. При отсутствии вакуумного термостата заводского изготовления его с успехом может заменить вакуумный сушильный шкаф типа "§РТ-200" (производства фирмы "Лабимскс", Польша).

Оптимальный для кампилобактеров состав атмосферы внутри микроанаэростата или вакуумного термостата может быть достигнут несколько более простым путем: газовой смесью заводского изготовления, состоящей из 10 проц. углекислого газа и 90 проц. азота, однократно заполняется пространство камеры аппарата, откуда предварительно откачан воздух до уровня, соответствующего отметке "-0,6 атм." - "-0,7 атм." шкалы манометра.

Разумеется, работа с газовой смесью предусматривает сборку проводящей системы металлических или резиновых трубок и вентилей, обеспечивающей рациональное манипулирование газовым потоком. Газовые смеси описанных выше составов не являются ни токсичными, ни взрывоопасными (ТУ-6-16-2956-87), и несущий их рабочий баллон может быть расположен в непосредственной близости от стационарных вакуумных термостатов; в то же время, запасные, нерабочие баллоны во избежание скопления углекислого газа в воздухе лаборатории вследствие случайной утечки газовой смеси следует хранить в отдельном подсобном помещении.

Чашки с посевами устанавливаются для инкубации в тот или иной сосуд или аппарат следующим образом: в эксикатор или СТО-10 - дном вверх, в микроанаэростат и вакуумный термостат - крышкой вверх; пренебрежение последним требованием зачастую приводит к отрыву питательной среды от дна чашки при резком падении давления во время откачивания газового содержимого. Следует также учесть, что стеклянные чашки Петри многократного использования (ГОСТ 10973-75) и пластмассовые чашки Петри однократного применения (ТУ 64-2-19-79) диаметром 90 мм одинаково приемлемы для использования их в операциях, включающих этап разрежения атмосферы внутри аппарата с последующим восстановлением исходного уровня давления газовой смеси, равного атмосферному, тогда как чашки Петри однократного применения диаметром 100 мм для этой цели не пригодны: конструкция чашки такого типа не защищает ее от механического разрушения при резких перепадах давления.

Более или менее надежные результаты могут быть получены при создании микроаэрофильных условий по принципу Фортнера, когда культивируемые совместно с исследуемым образцом бактерии родов Seratia, Acinetobacter, Providesia в ходе собственного метаболизма поглощают кислород, снижая его содержание в той или иной емкости до приемлемого для кампилобактера уровня. Методика инкубации по Фортнеру состоит в следующем: чашки с посевами исследуемых образцов вместе с чашками, засеянными газоном культуры любого из перечисленных выше микроорганизмов, помещают в полиэтиленовый пакет и после удаления из пакета избытка воздуха герметизирует в нем посредством многократного перекручивания свободных краев пакета с последующей фиксацией их аптечной резинкой.

Чашки с посевами, выполненными традиционным способом (см. раздел 4.1.3), инкубируют в созданных любым из вышеописанных способов микроаэрофильных условиях при 42 °С, чашки с посевами, выполненными с применением фильтров (см. раздел 4.1.3) - при 37 °С. Независимо от методики посева, способа создания микроаэрофильных условий и температуры инкубации, посевы выращивают в течение 72 часов с ежесуточным просмотром чашек и последующим воссозданием микроаэрофильных условий инкубации.

4.1.5. Изучение изолированных колоний

При ежесуточном просмотре чашек с целью обнаружения на них изолированных колоний, обладающих культуральными свойствами кампилобактера (см. раздел 3), не следует ограничиваться осмотром чашек невооруженным глазом, сколь бы тщательным он ни был - многие фенотипические особенности кампилобактера, а также наиболее часто встречающихся представителей сопутствующей ему в фекалиях микрофлоры могут быть выявлены лишь при осмотре изолированных колоний с помощью бинокулярной оптической системы типа МБС-2 или МБС-4 (производства Ленинградского оптико-механического объединения "ЛОМО") в проходящем и падающем свете. Мазки из материала колоний, обладающие культуральными свойствами кампилобактера, фиксируются в пламени горелки и окрашиваются 1-процентными растворами фуксина или кристаллического фиолетового (см. Приложение 3), после чего микроскопируются с иммерсией общепринятым способом.

Обнаружение в мазках из материала изолированных колоний бактериальных клеток типичной для кампилобактера морфологии (см. раздел 3) является основанием для пересева материала изученной изолированной колонии сплошным широким штрихом на поверхность селективной среды того же состава, что и среда, на которой была получена изолированная колония; материал колоний, выросших на поверхности питательной среды с бактериологическим углем в результате посева с применением фильтров, рассевается по поверхности среды того же состава. Посевы, выполненные с целью выделения чистой культуры, инкубируются при 42 °С в течение 48 час. в микроаэрофильных условиях или же при 37 °С - при пересеве с чашек культуры, полученной способом фильтров.

    Следует   учесть,   что   посев  пентагональным  штрихом - при  условии

стандартизации  техники  посева  -  является,  по  сути, полуколичественным

способом  оценки  уровня  обсемененности исследуемого материала: наличие, к

примеру,  изолированных  колоний  в  третьем  секторе  стандартного  посева

                                                        6

указывает на обсемененность образца, пропорциональную 10  колониеобразующих

единиц  в 1,0 мл его; обсемененность же исследуемого материала может быть с

легкостью рассчитана с учетом степени разведения его перед посевом.

4.1.6. Изучение чистоты выделенных культур

Из материала выделенных культур изготавливаются мазки: первый, фиксируемый в пламени горелки, - для окраски по Граму с целью оценки чистоты выделенной культуры и тинкториальных свойств ее; второй, типа "раздавленная капля" в 0,1-процентной пептонной воде - для оценки способности материала выделенной культуры к активному движению. Препарат типа "раздавленная капля" готовится следующим способом: на поверхность покровного тщательно обезжиренного стекла наносится небольшое количество 0,1-процентной пептонной воды, забранной стерильной бактериологической петлей с диаметром, не превышающим 2 мм, после чего в капле эмульгируется материал исследуемой культуры, внесенной с таким расчетом, чтобы мутность эмульсии не становилась чрезмерной; далее покровное стекло помещается каплей вниз на поверхность тщательно обезжиренного предметного стекла и придавливается к его поверхности ватно-марлевой пробкой большого размера таким образом, чтобы капля эмульсии культуры оказалась "раздавленной" двумя стеклами. Качество препарата типа "раздавленная капля" определяется, во-первых, площадью капли - она должна быть максимально возможной; во-вторых, отсутствием "затеков" капли за пределы покровного стекла.

Окрашенные по Граму мазки микроскопируются с иммерсией общепринятым способом; при оценке чистоты выделенной культуры следует учитывать, что материалу стареющих культур кампилобактера, то есть культур, культивирующихся более 24 час., свойственна тенденция к накоплению кокковых и гиперспирализованных форм (см. раздел 3), а также форм, сохраняющих типичные очертания, но значительно удлиненных и утолщенных. Изучение подвижности кампилобактера в "раздавленной капле" может быть осуществлено с помощью фазового контрастирования препарата. Наилучшие результаты дает применение фазово-контрастного конденсора КФ-4 (производства Ленинградского оптико-механического объединения "ЛОМО") при фазовом кольце и объективе "90" и масляной иммерсии, однако при отсутствии КФ-4 достаточно высокие результаты могут быть получены следующим путем: центральная часть конденсора микроскопа затемняется черной светонепроницаемой бумагой, имеющей форму круга с диаметром на 4 - 5 мм, уступающим диаметру линзы конденсора; при интенсивном освещении препарата и правильном эмпирически подобранном положении конденсора вследствие возникающего эффекта "темного поля" становится возможным прижизненное изучение бактериальных клеток.

Истинную активную подвижность бактериальных клеток следует отличать от броуновского движения, присущего любой лишенной жгутиков бактериальной клетке, взвешенной в пространстве "раздавленной капли": колебательные движения молекул жидкости заставляют бактериальную клетку совершать равномерные колебательные движения вокруг некоего среднего положения, тогда как активное движение, обусловленное вращением жгутиков, имеет отчетливо выраженную направленность. Кампилобактерам свойственна высокая подвижность, сравнимая с подвижностью холерного вибриона и превосходящая подвижность сальмонелл и эшерихий; движение его носит стремительный, мечущийся из стороны в сторону характер, "штопорообразно" ввинчивающийся в окружающую среду, тогда как движения сальмонелл и эшерихий напоминают движения плывущей лодки. Следует учесть, что к активному движению способны далеко не все обнаруживаемые в поле зрения бактериальные клетки, в то время как броуновскому движению подвержены все без исключения и в приблизительно равной степени. Материал культуры кампилобактера расценивается как способный к активному движению, если в 10 - 12 изученных полях зрения обнаруживается хотя бы одна активно движущаяся бактериальная клетка; в противном случае выделенную культуру следует расценивать как неспособную к активному движению, как минимум, в предложенных ей условиях культивирования.

4.1.7. Идентификация выделенных чистых культур

Выделенные чистые культуры подлежат немедленной идентификации с требуемым уровнем точности: для постановки клинического диагноза "кампилобактериоз" таким уровнем со всей строгостью может считаться установление родовой принадлежности, поскольку ОКЗ, вызываемые каждым из трех видов термофильного кампилобактериоза, клинически не дифференцируются (см. раздел 2); в то же время, для исчерпывающего эпидемиологического анализа необходимым является видовой и субвидовой уровни идентификации.

Родовая идентификация начинается, по сути, с этапа работы с изолированными колониями; факт обнаружения на поверхности элективной для кампилобактера питательной среды изолированных колоний типичной морфологии, развившихся в микроаэрофильных и капнофильных условиях при 42 °С и состоящих из грамнегативных высокоподвижных извитых форм, позволяет с высокой степенью вероятности утверждать, что выделенная культура принадлежит к роду Campylobacter. Окончательное решение вопроса о принадлежности выделенной культуры названному роду может быть вынесено на основании результатов тестов на способность к продукции цитохромоксидазы и каталазы, а также температурного теста и теста на способность к росту на среде Ресселя. Видовая принадлежность выделенной культуры кампилобактера определяется по результатам тестов на способность к быстрому гидролизу гиппурата натрия и резистентность к налидиксовой кислоте.

4.1.7.а. Тест на способность к продукции цитохромоксидазы выполняется следующим образом: материал исследуемой суточной агаровой культуры наносят на фильтровальную бумагу и добавляют 1 каплю 1-процентного свежеприготовленного водного раствора тетраметилпарафенилендиамина гидрохлорида; спустя 5 - 10 сек. цитохромоксидазапозитивная культура приобретает пурпурную окраску. Следует отметить, что материал исследуемой культуры должен быть отобран исключительно платиновой петлей (во избежание каталитического действия иных металлов на процесс спонтанного окисления реактива) или запаянной пипеткой Пастера. В качестве позитивного контроля компонентов реакции следует использовать суточную агаровую культуру любой псевдомонады, в качестве негативного - кишечной палочки. Референо-штаммы термофильных кампилобактеров, необходимые для использования их в качестве контрольных в настоящем и последующих идентификационных тестах (4.1.7.б - 4.1.7.в), могут быть получены из специализированных научно-исследовательских институтов (ЦНИИ эпидемиологии МЗ СССР; 111123, Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а; Ленинградский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера МЗ РСФСР; 197101, Ленинград, ул. Мира, д. 14).

В ряде случаев - при наличии достаточного числа изолированных колоний на поверхности питательной среды - тест может быть выполнен с материалом одной из них непосредственно на поверхности чашки: в этом случае 1 капля реактива наносится на исследуемую колонию и учет результатов аналогичным образом производится спустя 20 - 30 сек.

4.1.7.б. Тест на способность к продукции каталазы выполняется следующим образом: материал исследуемой суточной агаровой культуры суспендируют на поверхности предметного стекла в капле 3-процентного раствора перекиси водорода; спустя 3 - 5 сек. в взвеси каталазапозитивной культуры происходит интенсивное газообразование. В качестве позитивного контроля следует использовать суточную культуру кишечной палочки, негативного - любого стрептококка.

4.1.7.в. Тест на способность к росту на среде Ресселя, надежно дифференцирующий термофильный кампилобактер от обладающих множественной антибиотикорезистентностью, подвижностью и способностью к росту при 42 °С в микроаэрофильных условиях штаммов энтеробактерий, выполняется обычным образом: материалом исследуемой суточной агаровой культуры исследуемого штамма инокулируются столбик (посев уколом) и скошенная поверхность (посев штрихом) среды Ресселя. Учет результатов производится спустя 24 часа инкубации посева при 37 °С в аэробных условиях; термофильным кампилобактерам, в отличие от энтеробактерий, не свойственна способность к росту на среде Ресселя.

4.1.7.г. Температурный тест выполняется следующим образом: полной бактериологической петлей материала суточной агаровой культуры инокулируются 2 высоких столбика мясопептонно-печеночного полужидкого агара (МПППА; см. Приложение 3); посевы инкубируются в течение 48 часов в аэробных условиях - один при 25 °С, другой - при 37 °С. Термофильным кампилобактерам присуща способность к росту на МПППА при 37 °С, но не 25 °С; характер роста описан в разделе 3.

4.1.7.д. Тест на способность к быстрому гидролизу гиппурата натрия следует выполнять в строгом соответствии с предлагаемой схемой, так как пренебрежение даже малозначительными, на первый взгляд, деталями (тип используемых пробирок, способ внесения реактива и т.п.) неизбежно приводит к возникновению неинформативных результатов. Материал суточной агаровой культуры исследуемого штамма суспендируют в 0,4 мл 1-процентного водного раствора гиппурата натрия до мутности, соответствующей 10 единицам стандарта мутности; постановка теста осуществляется в преципитационных пробирках. Опытный образец инкубируется при 37 °С в течение 2 час. на водяной бане или в термостате; по истечении срока инкубации к суспензии исследуемого штамма по стенке, наклоненной под углом 45°, преципитационной пробирки осторожно наслаивается 0,2 мл нингидринового реактива (3,5-процентный раствор нингидрина в смеси ацетона и бутанола, взятых в соотношении 1:1 (об./об.). Внимание! Нингидриновый реактив готовится extempore. Пробирки, тщательно защищенные от случайного встряхивания, вновь помещаются на водяную баню на 10 мин., после чего производится учет результатов: о способности культуры к быстрому гидролизу гиппурата натрия свидетельствует образование темно-фиолетового окрашивания термостата: появление темно-фиолетового кольца спустя сутки суспензии исследуемой культуры. Появление фиолетового кольца или сиреневой окраски суспензии требует перестановки теста. Окончательный отрицательный результат может быть получен лишь спустя сутки дополнительной инкубации при 37 °С в режиме расценивается как сомнительный результат, требующий уточнения с помощью повторной постановки теста.

Следует учесть, что раствор гиппурата натрия не отличается стойкостью, в силу чего подлежит хранению при температуре, не превышающей -20 °С.

Способностью к быстрому гидролизу гиппурата натрия обладают штаммы C. jejuni, но не C. coli, и C. laridis (см. Приложение 1).

4.1.7.д. Тест на резистентность к налидиксовой кислоте выполняется следующим образом: материалом суточной культуры исследуемого штамма, выращенной на среде без антибиотиков, инокулируется (посев штрихом или бляшкой) поверхность чашечного эритрит-агара, среды АГВ или др. без добавления крови с 50 мг/л налидиксовой кислоты (см. Приложение 3), посевы инкубируются при 37 °С в течение 72 час. в микроаэрофильных условиях (см. раздел 4.1.4). Наличие роста в зоне инокуляции свидетельствует о резистентности исследуемой культуры к налидиксовой кислоте, отсутствие роста - о ее чувствительности; резистентностью к налидиксовой кислоте обладают штаммы C. laridis, чувствительностью - C. jejuni и C. coli (см. Приложение 1).

4.1.8. Определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам

Чувствительность выделенных культур кампилобактера к антибиотикам определяется с целью эпидемиологического анализа, а также с целью разработки схем рациональной антибиотикотерапии кампилобактериоза (следует учитывать, что эритотропная терапия кампилобактериоза, опирающаяся на применение эритромицина и ампиогликозидов (см. раздел 2), начинается с момента поступления больного в лечебное учреждение, в то время как результаты описываемого в настоящей рубрике исследования могут быть получены не ранее чем на 6 сутки пребывания больного в стационаре).

Поверхность тщательно подсушенного чашечного эритрит-агара, среды АГВ и др. без добавления крови инокулируется газоном густой взвеси в 0,1-процентной пептонной воде суточной агаровой культуры исследуемого штамма (мутность взвесью должна соответствовать, как минимум, 10 единицам стандарта мутности). Избыток посевного материала удаляется с поверхности чашки, и чашка выдерживается 30 - 40 мин. при комнатной температуре вплоть до полного впитывания инокулята в поверхность питательной среды. Далее, на поверхность инокулированной питательной среды укладываются стандартные диски со следующими антибиотиками: карбенициллином (укладывается в центр чашки), эритромицином, гентамицином, тетрациклином, канамицином, левомицетином, стрептомицином (равномерно укладываются по периферии чашки, на 10 - 12 мм отступив от ее края). Посевы инкубируются при 37 °С в течение 48 час. в микроаэрофильных условиях (см. раздел 4.1.4); учет результатов производится общепринятым способом путем измерения диаметров зон задержки роста культуры вокруг диска с тем или иным антибиотиком. Как правило, культуры термофильного кампилобактера резистентны к карбенициллину и чувствительны к эритромицину и гентамицину.

4.1.9. Типирование выделенных культур

Наиболее эффективным способом типирования термофильного кампилобактера является сочетанное серологическое и биохимическое типирование. В зарубежной практике широко применяются схемы серотипирования кампилобактера по термолабильному к термостабильному антигенным комплексам с помощью соответствующих панелей диагностических антисывороток или диагностикумов для латекс- и коагглютинации; также разработаны и схемы биохимического типирования кампилобактера по способности к продукции сероводорода, гидролизу, ДНК и т.д. В СССР не разработано отечественной схемы серологического типирования кампилобактера и соответствующей ей панели диагностических антисывороток, вследствие чего типирование культур термофильного кампилобактера, выделенного в различных регионах страны, может быть осуществлено лишь в специализированных лабораториях научно-исследовательских учреждений (ЦНИИ эпидемиологии МЗ СССР; Ленинградский НИИЭиМ им. Пастера МЗ РСФСР), куда и следует направлять выделенные культуры для окончательной идентификации и типирования.

Схем фаготипирования термофильного кампилобактера в СССР не разработано.

4.1.10. Хранение выделенных культур

Свежевыделенные культуры кампилобактера не отличаются высокой резистентностью к факторам окружающей среды, вследствие чего длительное хранение их в режиме бытового холодильника не представляется возможным. На чашечных средах ЖЭКа, АГВ, МППА, эритрит-агаре с 5 - 10 проц. крови культуры кампилобактера при 4 °С в аэробных условиях сохраняют жизнеспособность в течение 3 - 5 дней; на скошенных пробирочных средах того же состава с половинной против селективной концентрацией антибиотиков их жизнеспособность в том же режиме хранения сохраняется до 5 - 7 дней. Культуры, выращенные на МПППА (см. Приложение 3), в течение 48 часов при 42 °С в аэробных условиях сохраняют жизнеспособность при 4 °С в течение 10 - 14 дней; культуры такого типа наиболее приемлемы для транспортировки в специализированные лаборатории в обычных условиях

Наиболее эффективным является хранение культур кампилобактера в условиях глубокого замораживания в присутствии криопротектора (глицерин, сыворотка, кровь); рекомендуемая среда с криопротектором для консервации культур кампилобактера (см. Приложение 3) обеспечивает выживание его при -20 °С в течение 1 - 2 лет, при -70 °С - до 10 лет, при - 196 °С (температура жидкого азота) - неопределенно долгое время. Материал суточной агаровой культуры консервируемого штамма смывается с помощью шпателя с поверхности плотной питательной среды 1,0 мл среды для консервации, после чего пипеткой Пастера разливается по 0,2 - 0,3 мл по стерильным ампулам. Далее ампулы либо запаливаются в пламени горелки, либо их устье прикрывается ватным тампоном и парафинируется, после чего ампулы маркируются и помещаются в морозильные камеры либо в сосуды с жидким азотом.

Лиофильное высушивание культур кампилобактера обеспечивает лишь 50-процентную выживаемость его; как и глубокому замораживанию, лиофильному высушиванию подвергаются суточные культуры штаммов, суспендированные в жидкой среде того или иного состава (см. Приложение 3). Лиофилизированные культуры подлежат хранению при 4 °С неопределенно долгое время.

"Оживление" как замороженных, так и лиофилизированных культур осуществляется на питательных средах с кровью и антибиотиками при 42 °С в течение 48 часов в микроаэрофильных условиях.

Схема лабораторной диагностики кампилобактериоза с помощью бактериологического метода исследования представлена в Приложении 2.

4.2. Микроскопический метод исследования.

    Микроскопический  метод  исследования при диагностике кампилобактериоза

приносит   достоверные  результаты  лишь  при  обсемененности  исследуемого

                              5

материала,  пропорционально 10  колониеобразующих единиц в 1 мл материала -

при   более   низком   уровне   обсемененности  частота  ложноотрицательных

результатов     оказывается    неприемлемо    высокой.    Таким    образом,

микроскопический   метод   исследования   может   расцениваться   лишь  как

дополнительный метод исследования в диагностике кампилобактериоза. Методика

микроскопической  диагностики весьма напоминает методику оценки подвижности

выделенных  чистых  культур  кампилобактера  (см.  раздел 4.1.6) с той лишь

разницей,   что  препарат  типа  "раздавленная  капля"  изготавливается  из

эмульсии  нативных  фекалий  без  применения 0,1-процентной пептонной воды;

микроскопирование   с   применением   фазового   контрастирования   и  учет

результатов  осуществляются описанным выше образом. Хотя бактериологическое

подтверждение   любого  результата  микроскопического  метода  исследования

является   безусловно   необходимым,   в   случае  обнаружения  в  фекалиях

высокоподвижных   извитых  форм  типичной  для  кампилобактера  морфологии,

предварительный      результат      исследования      следует      сообщить

врачу-инфекционисту.

4.3. Серологический метод исследования.

Серологический метод исследования при кампилобактериозе играет весьма важную роль при широкомасштабных эпидемиологических исследованиях, в то время как его роль в диагностике кампилобактериоза относительно невелика. В зарубежной практике весьма широко используются как традиционные, так и современные методики серологического исследования (иммуноферментный анализ, иммунный блоттинг, иммуноэлектрофорез, непрямая гемагглютинация, латекс-агглютинация). Каждая из перечисленных серологических реакций имеет определенные достоинства, но тем не менее не позволяет достаточно надежно диагностировать кампилобактериозную инфекцию. В СССР диагностикумы для перечисленных реакций находятся в стадии разработки.

 

Приложение 1

 

ВАЖНЕЙШИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ

ТЕРМОФИЛЬНОГО КАМПИЛОБАКТЕРА

 

Признак	Продукция		Подвижность в "раздав- ленной кап- ле"	Рост при		Рост на среде Ресселя	Гидролиз гиппура- та нат- рия	Резистент- ность к   налидиксо- вой кисло- те
Вид	окси- дазы	ката- лазы		25 °С	37 °С
C. jejuni	+	+	+	-	+	-	+	-
C. coli	+	+	+	-	+	-	-	-
C. laridis	+	+	+/-	-	+	-	-	+

 

    Условные обозначения: "+" - признак определяется у 100% штаммов;

                          "+/-" - признак определяется у 50% штаммов;

                          "-" - признак не определяется.

 

Примечание. По нашим данным, в этиологической структуре кампилобактериоза на долю C. jejuni приходится 83,7% случаев, на долю C. coli - 15,8%, C. laridis - 0,5%.

 

 

 

 

 

Приложение 2

 

СХЕМА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА

С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ

 

I этап.

а) забор материала и его транспортировка;

б) подготовка исследуемого материала к работе;

в) первичный высев штрихом или шпателем на поверхность селективных кровяных питательных сред; инкубация при 42 °С в микроаэрофильных условиях;

г) посев на угольную среду с применением фильтров; инкубация при 37 °С в микроаэрофильных условиях.

II этап.

а) просмотр чашек, макроскопическое изучение изолированных колоний;

б) микроскопическое изучение изолированных колоний;

в) пересев материала изолированных колоний на среду соответствующего состава (селективную кровяную или угольную) с целью выделения чистой культуры.

Примечание. Продолжительность этапа II может составлять до 3 суток, поскольку в течение предусмотренных 72 часов инкубации посевов предполагается ежесуточный просмотр чашек; в случаях, когда спустя 24 или 48 час. инкубации на поверхности питательных сред не обнаруживается изолированных колоний, посевы подлежат дальнейшей инкубации в тех же условиях.

 

III этап.

а) проверка чистоты выделенной культуры;

б) оценка подвижности выделенной культуры;

в) постановка идентификационных тестов;

г) учет результатов тестов на способность к продукции оксидазы, каталазы и быстрому гидролизу гиппурата натрия;

д) постановка теста на чувствительность выделенной культуры к антибиотикам;

е) посев газона выделенной культуры для консервации.

IV этап.

а) учет результатов тестов на способность к росту на среде Ресселя и при 25 °С, и 37 °С;

б) консервация выделенной культуры.

V этап.

а) учет результатов теста на способность к росту в присутствии налидиксовой кислоты (резистентность к налидиксовой кислоте);

б) учет результатов теста на чувствительность выделенной культуры к антибиотикам;

в) заключение, оформление результатов бактериологической диагностики.

Примечание. Лабораторная работа с культурами кампилобактеров должна проводиться согласно режимным моментам работы с патогенными культурами III группы.

 

 

 

 

 

Приложение 3

 

МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА

С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ

 

А. Красители

I. Окраска по Граму

На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтрованной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генцианового фиолетового на 0,5 - 1 мин. Затем наливают раствор Люголя на 1 мин. После чего прополаскивают препарат в 95% спирте в течение 0,5 - 1 мин., пока не перестанет отходить краситель. Промывают водой. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 0,5 - 1 мин. Краситель сливают, препарат промывают и высушивают.

II. Окраска кристалл-виолетом

На 200 мл раствора краски необходимо иметь:

- 250 мг кристалл-виолета;

- 450 мг карболовой кислоты кристаллической.

Навески растворить в 20 мл этилового спирта - 96°. Смесь оставить на 24 часа, затем добавить 180 мл дистиллированной воды.

Окраска мазков - в течение 30 сек.

III. 1-процентный раствор фуксина

а) Исходный насыщенный раствор фуксина:

Основной фуксин - 1,0 г;

Карболовая кислота кристаллическая - 5,0 г;

Глицерин - 0,5 мл;

Спирт этиловый 96° - 10,0 мл;

Вода дистиллированная - 100 мл.

Краситель растирается в фарфоровой ступке с карболовой кислотой и глицерином при постоянном добавлении небольшими порциями этилового спирта; после образования гомогенной массы небольшими порциями добавляется дистиллированная вода при постоянном тщательном перемешивании. Полученный раствор фильтруют через влажный бумажный фильтр и хранят в склянке темного стекла с плотно притертой крышкой; раствор весьма стоек и подлежит длительному хранению.

б) Рабочий раствор:

Исходный насыщенный раствор - 1,0 мл;

Вода дистиллированная - 10,0 мл.

Рабочий раствор стоек и подлежит длительному хранению.

Б. Транспортные питательные среды

I. 0,1-процентная пептонная вода:

Вода дистиллированная - 100,0;

Пептон бактериологический - 0,1 г;

Натрия хлорид - 0,5 г;

Калия нитрат - 0,1 г;

Натрия бикарбонат - 0,2 г;

рН - 7,4.

Среда разливается по пробиркам и стерилизуется в режиме автоклава при 1,1 атм. и 121 °С в течение 15 мин.

II. Среда для контроля стерильности (КС)

Для приготовления среды берется навеска 20 г/л коммерческого препарата, выпускаемого предприятием "Биомед" им. И.И. Мечникова МЗ СССР. Среда питательная для контроля стерильности сухая. Далее согласно прилагаемому наставлению готовая среда разливается по пробиркам в объеме 3,0 - 5,0 мл и стерилизуется при 1,1 атм. и 121 °С в течение 20 мин.

В. Среды для выделения термофильных кампилобактеров из биологических субстратов

I. Железо-эритрит - кровяной агар (ЖЭКА)

Среда готовится из выпускаемого НПО "Питательные среды" эритрит-агара, широко применяющегося для выделения бруцелл, следующим образом: навеска сухого эритрит-агара (36,0 г) растворяется при нагревании и непрерывном помешивании в 1,0 л дистиллированной воды; после растворения эритрит-агара к смеси добавляются экстракт кормовых дрожжей (4,0 г) и сернокислое закисное железо (0,04 - 0,15 г). Среда кипятится на медленном огне в течение 3 - 5 мин. без пригорания и далее стерилизуется при 1,1 атм. и 121 °С в течение 20 мин. в режиме автоклава. К остуженной после стерилизации до 45 - 50 °С питательной среде добавляются 7% лизированной бараньей крови (или 10-проц. цельной бараньей, или 7-проц. лизированной лошадиной, или 5-проц. лизированной человеческой донорской), а также раствор смеси антибиотиков (см. ниже). Среда тщательно, но без взбалтывания, перемешивается и разливается по чашкам; чашки подлежат хранению при 4 °С в течение 14 дней. Перед употреблением чашки подсушиваются в течение 40 - 60 мин. при 37 °С в режиме термостата.

Примечание. Каждая серия селективной среды ЖЭКА подлежит проверке на поддержание жизнеспособности кампилобактеров путем титрованного высева стандартного штамма C.jejuni (M457). Культура может быть получена в лиофилизированном состоянии в Центральном НИИ эпидемиологии Минздрава СССР (111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а).

 

II. Селективный эритрит-агар

Среда готовится аналогичным среде ЖЭКА образом, с учетом того обстоятельства, что в ее состав входят 0,05% пирувата и 0,05 метабисульфита натрия.

Г. Среда для постановки идентификационных тестов и определения антибиотикочувствительности кампилобактеров

I. Среда АГВ

Среда готовится согласно наставлению, прилагаемому изготовителем - НПО "Питательные среды" (г. Махачкала).

Готовые чашки со средой подлежат хранению при 4 °С в течение 5 - 7 дней. Перед употреблением чашки подсушивают в режиме термостата при 37 °С 20 - 30 минут.

Д. Кровяные добавки

Баранья или лошадиная кровь, асептически взятая у здоровых животных, дефибринируется с помощью стеклянных бус и хранится до использования при 4 °С в течение 7 - 10 дней. Человеческая донорская кровь в виде препарата "Гемолизированная кровь для питательных сред" выпускается Ленинградскими НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (197101, Ленинград, ул. Мира, д. 14).

Е. Смеси антибиотиков

 

I. Смесь N 1                  II. Смесь N 2

Рифампицин - 20 мг/л          Полимиксин В - 2 мг/л

Фузидин - 10 мг/л             Рифампицин - 10 мг/л

Амфотерицин В - 3 мг/л        Амфотерицин В - 3 мг/л

Цефалотин - 15 мг/л           Ристомицин - 10 мг/л

 

Необходимые количества антибиотиков взвешиваются на торсионных весах и вносятся во флакон с 3,0 мл дистиллированной воды и 0,05 мл диметилсульфоксида (или 5 - 7 каплями этилового спирта); смесь растворяется при тщательном перемешивании.

Ж. Среды для транспортировки и консервации чистых культур

I. Мясопептонно-печеночный - полужидкий агар (МПППА):

Мясная вода - 250,0 мл;

Печеночный отвар - 250,0 мл;

Вода дистиллированная - 500,0 мл;

Пептон бактериологический сухой - 10,0 г;

Натрий хлористый - 5,0, агар-агар - 1,6 г;

рН 7,2 - 7,4.

Питательная среда описанного состава после непродолжительного кипячения без пригорания (до растворения агар-агара) стерилизуется в режиме автоклава при 1,1 атм. и 121 °С в течение 20 мин.

МПППА, помимо транспортировки, может быть использован для хранения выделенных культур и постановки температурного теста.

II. Среда для консервации культур кампилобактера при низких температурах

Вода дистиллированная - 75,0 мл;

Глицерин - 25,0 мл;

Пептон бактериологический сухой - 1,0 г;

Натрий хлористый - 0,5 г;

рН 7,2 - 7,4.

Среда стерилизуется в режиме автоклава при 1,1 атм. и 121 °С в течение 15 мин.

III. Криопротекторы для лиофилизации культур кампилобактеров

1. Лиофилизация в сахарозе

В 1 мл мясопептонно-печеночного бульона делают густую взвесь культуры кампилобактера и добавляют 1 мл 24% стерильного раствора сахарозы. Далее методика лиофилизации не отличается от общепринятой.

2. Лиофилизация в молоке

В качестве криопротектора используют 20% снятое молоко, стерилизованное порциями (по 5 мл) в течение 20 мин. при 116 °С. Внимание! После лиофилизации все ампулы должны быть закрыты под вакуумом.

З. Среда для выделения термофильных кампилобактеров с помощью фильтров

1. Среда с активированным углем

Эритрит-агар коммерческий - 36,0 г;

Сернокислое закисное железо - 0,15 г;

Экстракт кормовых дрожжей - 4,0 г;

Уголь бактериологический активированный - 4,0 г;

Вода дистиллированная - 1,0 л;

рН 7,2 - 7,4.

После приготовления аналогичным со средой ЖЭКА способом среда с активированным углем стерилизуется в режиме автоклава при 1,1 атм., 121 °С в течение 20 мин., после чего разливается по чашкам и хранится при 4 °С в течение 14 - 20 дней. Перед употреблением чашки со средой подсушиваются в режиме термостата при 37 °С в течение 40 - 60 мин.

И. Фильтры

I. Мембранные фильтры

Мембранные фильтры типа "Владипор" N 5 и N 6 производства Казанского производственного объединения "Тасма" подготавливаются к употреблению следующим образом. Необходимое для посева количество фильтров N 6 дважды отмывается кипячением в дистиллированной воде в течение 20 мин. с момента закипания, после чего кипятится третий раз в 0,01-процентном растворе Твина 20 или 80 (Tveen 20, 80) и стерильным пинцетом укладывается на поверхность питательной среды, после чего чашки подсушиваются в режиме термостата при 37 °С до исчезновения крупных капель воды (приблизительно в течение 30 - 40 минут).

II. Ядерные фильтры

Ядерные фильтры производства Объединенного института ядерных исследований (141980, Московская область, г. Дубна, Отдел прикладной ядерной физики) подготавливаются к работе одним из следующих способов:

а) полотно ядерного фильтра ножницами разрезается на квадраты размером 2 х 2 см, квадраты перекладываются бумагой и стерилизуются в режиме автоклава при 1,1 атм. и 121 °С в течение 20 мин. либо в сухожаровом шкафу при температуре 170° в течение 60 мин.;

б) вырезанные из полотна кусочки ядерного фильтра размером 3 х 3 см с помощью резинового кольца закрепляются в металлическом кольце диаметром 15 - 20 мм и высотой 5 - 7 мм; полученные таким образом обоймы укладываются в футляр и стерилизуются в режиме автоклава при 1,1 атм. и 121° в течение 20 мин.

В отличие от мембранных, ядерные фильтры могут быть использованы неоднократно; после обеззараживания кипячением, тщательного промывания водопроводной водой и стерилизации, сохранившие целостность фильтры могут быть использованы повторно.

К. Среда выращивания культур кампилобактеров

Мясопептонно-печеночный агар

Мясная вода - 250,0 мл;

Печеночный отвар - 250,0 мл;

Вода дистиллированная - 500,0 мл;

Пептон бактериологический - 10,0 г;

Натрий хлористый - 5,0 г;

Агар-агар - 20,0 г;

рН 7,2 - 7,4.

Питательная среда описанного состава после непродолжительного кипячения без пригорания (до растворения агар-агара) стерилизуется в режиме автоклава при 1,1 атм. и 121 °С в течение 20 мин. Остуженная до 45 °С питательная среда смешивается с лизированной лошадиной кровью следующим образом: к 200,0 мл стерильной дистиллированной воды асептически добавляется 70,0 мл стерильной дефибринированной лошадиной крови, после чего смесь выдерживается при комнатной температуре в течение 15 - 20 мин. до полного лизиса эритроцитов; далее лизированная кровь добавляется к остуженному агару и разливается немедленно по чашкам. Если это необходимо, вслед за лизированной кровью добавляется раствор смеси антибиотиков. Чашки подлежат хранению при 4 °С в течение 14 дней. Перед употреблением чашки подсушиваются в режиме термостата при 37 °С.