Утверждаю
Заместитель главного
государственного врача БССР
В.Г.ЖУКОВСКИЙ
20 мая 1991 г. N 4-18/1890
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ
ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ
ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Разработаны Институтом питания АМН СССР,
кафедрой общей гигиены Белорусского Государственного
института усовершенствования врачей Минздрава СССР.
Предназначены для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах
санитарно-эпидемиологическими станциями, а также заводскими и
сельскохозяйственными лабораториями.
Введение
Среди ряда посторонних веществ, которые
могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают
лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками
лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и
птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов и т.п.
Номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно
расширяется.
К сильнодействующим лекарственным
препаратам, используемым в ветеринарии и животноводстве, относятся антибиотики.
Известно большое число антибиотиков, природных и полусинтетических, обладающих
различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в
организме животного, характером метаболизма и др.
Широкое применение антибиотиков в
ветеринарии и животноводстве создает определенные проблемы с точки зрения
гигиены питания, требует проведения соответствующих мероприятий для снижения
уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах
животноводства.
При систематическом поступлении в
организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические
реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, подавлять активность некоторых
ферментов, изменять микрофлору, способствовать распространению устойчивых форм
микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния
антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда
технологических процессов по переработке мяса, рыбы, молока и других продуктов,
кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические
исследования качества продуктов животного происхождения.
В мясе, печени,
почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйце, рыбе, меде и других продуктах
довольно часто обнаруживают остаточные количества антибиотиков, что
предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или
систематического их контроля. Некоторые
из перечисленных продуктов являются диетическими (молоко, творог, сметана и
др.), поэтому отсутствие в них токсических и лекарственных соединений особенно
важно.
В СССР остаточные количества ряда
антибиотиков регламентированы предельно допустимыми концентрациями (ПДК)
<*>. К ним относятся тетрациклины (0,01 ед./г), пенициллины (0,01 ед./г)
и стрептомицин (0,5 ед./г).
--------------------------------
<*> Медико-биологические требования
и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М.,
Издательство стандартов, 1990 г.
Для контроля уровней этих антибиотиков
Минздравом СССР утверждены микробиологические методы определения, которые
позволяют обнаруживать и идентифицировать группы указанных веществ на уровне
ПДК.
Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол)
- эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещен к
использованию в животноводстве и ветеринарии для лечения скота, птицы, мясо,
молоко и яйца которых предназначены для питания людей. Это связано с
токсичностью левомицетина, проявляющейся в аллергических реакциях, поражении
кроветворных органов и др. Однако относительная дешевизна этого препарата и
высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его
в относительно высоких масштабах.
Микробиологические методы неэффективны
для анализа этого антибиотика в пищевых продуктах, т.к. найденные тест-культуры малочувствительны и не позволяют осуществлять
контроль за остаточными количествами левомицетина хотя бы на уровне ПДК других
антибиотиков, разрешенных к применению.
В связи с этим за рубежом наиболее часто
применяют химические методы определения левомицетина в пищевых продуктах с
использованием хроматографического разделения.
В настоящих Методических рекомендациях
впервые в СССР предпринята попытка применения для контроля остаточных количеств
левомицетина в пищевых продуктах простого химического метода анализа,
основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем,
концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от
коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде
производного с n-деметиламинобензальдегидом.
Доступность реактивов и оборудования
позволяет рекомендовать этот метод для серийных анализов пищевых продуктов в
условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных лабораторий.
Предел обнаружения левомицетина на
хроматографической пластинке 5 - 10 нг в зоне. Относительное
стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при
спектрофотометрическом - 0,2. Метод позволяет проводить анализ
левомицетина при содержании его 0,05 мг/кг продукта и выше.
Метод состоит из следующих основных
стадий:
1. Отбор и подготовка пробы.
2. Извлечение левомицетина из пищевых
продуктов и концентрированного экстракта.
3. Хроматографическое разделение,
идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.
4. Подтверждение наличия левомицетина в
пробе.
5. Количественное определение и расчет
содержания левомицетина в продукте.
Аппаратура,
материалы и реактивы
Гомогенизатор тканей по
<...>
Спектрофотометр СФ-26 или аналог
Термостат ТС-80М-2 или аналог
Азот, поверочный нулевой газ
Центрифуга настольная по <...>
375-4261 или аналог
Ротационный испаритель с крышкой по ТУ
25-11-917
Баня масляная или глицериновая
Камера для тонкослойной хроматографии с
притертой крышкой, например стеклянный четырехгранный сосуд 195 x 195 x 200 мм
завода "Дружная горка".
Пластины для тонкослойной хроматографии
"Силуфол" размером 15 x 15 см, ЧСФР или Сорбфил 100 x 100 (г.
Краснодар) ТУ 26-11-17-89
Ножницы
Весы технические по ГОСТ 24104
Весы аналитические по ГОСТ 24104
Линейка
Карандаш графитовый М или аналог
Цилиндры мерные вместимостью 25 и 100 мл
по ГОСТ 1770
Колбы плоскодонные на 250 и 500 мл с НШ N
14,5 по ТУ 48-52
Колбы мерные на 25 мл по ГОСТ 1770
Пипетки на 5 и 10 мл по ГОСТ 20292
Колбы для упаривания на <...> мл с
НШ N 14,5 по ГОСТ 10394
Микрошприц на 10 и 25 мкл
Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ
4166
Серная кислота по ГОСТ 14262 <...>
1 н
Этилацетат по ГОСТ <...>
Натрий хлористый по ГОСТ <...>
насыщенный раствор в воде
Натрий углекислый по ГОСТ <...> 2%
водный раствор
Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-87
Петролейный эфир, фракции <...>
Метанол
бета-глукуронидаза, водный раствор 1
мг/мл
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Кислота соляная, конц. по ГОСТ 3118
Хлорид
олова (II), восстанавливающий
реактив: 3 мл 15% раствора SnCl
2
(в воде) + 15 мл
HCl + 180 мл H O
конц. 2
Левомицетин
Однозамещенный фосфат калия
Двузамещенный фосфат натрия
1. Отбор и
подготовка проб
Способ отбора и подготовки проб должен
быть указан в нормативно-технической документации на конкретную продукцию.
2. Извлечение
левомицетина из пищевых продуктов
и концентрирование экстракта
Мясо
<*>. 10 +/-
0,1 г гомогенизируют с 15 мл 0,025 М фосфатного
буфера, pH 6,88
(0,34 г KH PO
и 0,36 г Na HPO
растворяют в 100 мл
2 4 2 4
дистиллированной воды),
добавляли 200 мкл
водного раствора
бета-глукуронидазы и
инкубировали 1,5 часа
при 37 °С.
Гомогенат
экстрагировали 3
x 30 мл
этилацетата, при необходимости применяя для
расслоения суспензии
центрифугирование 5 - 10 мин.
при 4000 об./мин.
Этилацетатный
слой объединяли.
--------------------------------
<*>
Аналогично извлекали левомицетин
из мясных продуктов, органов и
тканей животных.
Молоко
<**>. 25 +/-
0,1 мл насыщают
10 г Na SO , приливают 10 мл
2 4
этилацетата и
5 мл 1 н H SO ,
интенсивно встряхивают 1 - 2 мин. Для
2 4
расслоения эмульсии
применяют центрифугирование 5 - 10
мин. при 4000
об./мин. Этилацетат декантируют, а
супернатант экстрагируют последовательно
30 и
20 мл этилацетата, при
необходимости применяя центрифугирование для
расслоения.
--------------------------------
<**> Аналогично извлекали левомицетин
из кефира, ряженки, йогуртов.
Яйцо
<***>. 10 +/-
0,1 г гомогената яйца перетирают с 5 г Na SO ,
2 4
приливают 40 мл
этилацетата и 5 мл 1 н H SO , перемешивают и центрифугируют
2 4
5 -
10 мин. при
4000 об./мин.
Этилацетатный слой декантируют, а водную
часть экстрагируют последовательно 30
и 20 мл
этилацетата, при
необходимости применяя
центрифугирование для расслоения.
Объединенные
этилацетатные экстракты
из продуктов промывают последовательно 10 мл 2%
раствора Na CO ,
насыщенного NaCl, и 10 мл насыщенного раствора NaCl.
2
3
----------------------------
<***>
Яичный порошок предварительно разводят
водой до консистенции
жидкой сметаны.
Органический слой
отбирают и упаривают на
ротационном испарителе при
температуре <=
50 °С до
минимального объема, отдувают
азотом до
исчезновения запаха
этилацетата, добавляют 3 мл смеси
ацетонитрил - вода
1:4 и
экстрагируют 3 x 5
мл петролейного эфира.
Петролейный эфир
отбрасывают и извлекают левомицетин этилацетатом (3 x 5
мл). Этилацетатный
экстракт сушат
над Na SO (1 г), декантируют, промывают 3 мл
этилацетата
2 4
сульфат натрия,
объединяют его с экстрактом
и упаривают на ротационном
испарителе при
температуре <= 50 °С досуха. Остаток растворяют в 200 мкл
метанола.
3.
Хроматографическое разделение,
идентификация и ориентировочная оценка
концентрации
левомицетина в экстракте
3.1. Приготовление
стандартных растворов
Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в
мерную колбу на 25 мл и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина - 1
мг/мл. 0,25 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл и
разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10
нг/мкл.
При анализе сметаны ее разбавляют в 2,5 -
5 раз в зависимости от жирности. Сыры и творог гомогенизируют с водой до
получения гомогенной массы.
3.2.
Хроматографическое разделение
На пластинку для тонкослойной
хроматографии наносят (рис. а - рисунки здесь и далее не приводятся): в точки
1, 3 и 5 соответственно 1, 2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4
соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.
Пластинку
помещают в камеру
для ТСХ и
хроматографируют в системе
растворителей хлороформ
- метанол 10:1.
По достижении фронтом элюента
верхнего края пластинки ее вынимают, сушат,
опрыскивают раствором SnCl в
2
HCl, оставляют на
15 мин. и
опрыскивают раствором
n-диметиламинобензальдегида. Появление
желтых пятен на хроматографической
пластинке по
оттенку и R , соответствующих
пятнам стандарта,
f
свидетельствует о возможном присутствии левомицетина в
продукте. Сравнивая
интенсивность окраски
пятен стандартов и
опытной пробы, ориентировочно
оценивают
содержание левомицетина в экстракте.
4. Подтверждение наличия
левомицетина в пробе
Аликвотную
часть экстракта (50 - 100 мкл)
упаривают досуха, добавляют
150 мкл
10% раствора HCl, греют на
масляной бане при температуре 98 °С в
течение 30 мин.,
отдувают досуха азотом и приливают 200 мкл 2% метанольного
раствора N CO .
2
3
На
хроматографическую пластинку
наносят 5 - 10 мкл полученной пробы и
соответствующее количество стандарта левомицетина (с учетом
предварительной
оценки содержания
левомицетина в экстракте);
пластинку помещают в камеру
для ТСХ
и хроматографируют в системе
растворителей хлороформ - метанол -
уксусная кислота
- вода 12:5:4:2.
По
достижении фронтом элюента
верхнего края пластинки ее
вынимают,
сушат, опрыскивают
раствором SnCl в
HCl, оставляют на 15 мин. Вновь
2
опрыскивают раствором
n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен
на хроматографической пластинке
по оттенку и R , соответствующих пятнам
f
стандарта,
подтверждает наличие левомицетина в продукте.
5. Количественное определение
и расчет
содержания левомицетина в
продукте
При
необходимости точного количественного определения левомицетина в
пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько
точек,
близко расположенных друг к
другу, аликвотную часть экстракта и таким же
образом раствор
стандарта так, чтобы количество левомицетина в нем было
близко к установленному в пробе
при ориентировочной визуальной оценке.
Пластинку хроматографируют и
опрыскивают как в
п. 3.2. Вырезают зоны
левомицетина в
опытной пробе, стандарте и соответствующую по
R и площади
f
зону на
пластинке, служащую контролем
(рис. б). Зоны элюируют 3 x 1 мл
метанола, метанол
упаривают досуха, приливают 200 мкл 5% раствора SnCl в
2
5% HCl, греют
при температуре 98 °С в течение
1 часа; пробы
охлаждают,
добавляют по 2 мл 1% раствора
n-диметиламинобензальдегида в метаноле, 1 мл
метанола и
измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы
и стандарта относительно контрольной пробы на
спектрофотометре в кюветах с
l = 10 мм при лямбда = 430 нм.
Рассчитывают содержание левомицетина в
пробе продукта по формуле:
ОП x P x V
-3 о
C = 10 x k x ------------- (мг/кг),
ОП x V x
M
ст 1
где:
k - коэффициент, учитывающий
полноту извлечения левомицетина из
пищевого продукта
и равный 1,33 для мяса, 1,13 - для молока и
1,25 - для
яиц;
ОП
- оптическая плотность элюата опытной пробы, относ.
ед.;
о
ОП
- оптическая плотность элюата стандарта, относ.
ед.;
ст
P - количество стандарта левомицетина,
нанесенного на пластинку, мкг;
V - объем анализируемой пробы, мкл;
V -
объем аликвотной части
экстракта, взятой для количественного
1
определения,
мкл;
M - масса образца пищевого продукта, кг (л).
Интервал определяемых масс левомицетина
составляет 0,5 - 6,0 мкг.
Вычисления проводят до второго
десятичного знака.
За окончательный результат испытаний
принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение
между которыми не превышает 20%.
Окончательный результат округляют до
первого десятичного знака.
Заключение
В случае обнаружения остаточных количеств
левомицетина и подтверждения правильности его идентификации в исследуемых
пищевых продуктах вопрос с их реализацией решается согласно "Методическим
указаниям по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах
животноводства". Москва, Минздрав СССР, ГОЭУ. 1985 г., 34 с. <*>
--------------------------------
<*> N 3049-84 от 29 июня 1984 г.
РЕЦЕНЗИЯ
НА МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ,
ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ
ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Представленные рекомендации являются
первой в СССР попыткой наладить систематический контроль за
наличием и уровнями левомицетина в пищевых продуктах. До настоящего времени
анализ левомицетина при необходимости выполняли микробиологически. Однако, отсутствие чувствительных тест-культур не позволяет
рассчитывать на обнаружение микрограммовых количеств этого антибиотика такими
способами. В связи с этим особенно важно создание химического метода контроля
остаточных количеств левомицетина, позволяющего с небольшими затратами
обнаружить, идентифицировать и количественно определить его содержание.
Левомицетин обладает определенной токсичностью и поэтому запрещен
к использованию как у нас в стране, так и за рубежом для лечения, например,
лактирующих коров или кур-несушек. Анализ литературных данных позволяет сделать
заключение, что применение его для лечения сельскохозяйственных животных и
птицы - достаточно частое явление, оправданное дешевизной и эффективностью
препарата.
Интенсификация сельскохозяйственного
производства может стать одной из причин снижения качества пищевых продуктов и,
в частности, загрязнения их антибиотиками. Поэтому своевременный и надежный контроль за наличием левомицетина становится важным и
актуальным.
Все отмеченное позволяет рекомендовать
утвердить разработанные методические рекомендации для внедрения в практику
работы учреждений Госсаннадзора. Полученные этим методом материалы
целесообразно обобщить для создания общей картины частоты и уровней загрязнения
пищевых продуктов БССР левомицетином.
Руководитель отдела гигиены питания
Института питания АМН СССР, профессор
Г.И.БОНДАРЕВ