Утверждены
Министерством здравоохранения СССР
29 июля 1991 г. N 6072-91
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТАБОЛИТОВ ФОП, ПРОИЗВОДНЫХ
ТИО- И ДИТИОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ В
БИОМАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ
ТОНКОСЛОЙНОЙ И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Настоящие Методические указания
предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и
научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных,
агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и
лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств
пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания,
кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и
рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по
химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.
1. Краткая
характеристика препарата
Производные тио-
и дитиофосфорных кислот являются основными метаболитами фосфорорганических
пестицидов. Характеристика метаболитов ФОП представлена в таблице 1.
Таблица 1
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ
┌─────────────────────────────────┬───────────┬────┬──────────────┬───────────┐
│
Химическое название │Структурная│Мол.│ T. кип., °C │Показатель │
│ │ формула
│вес │ │преломления│
│ │ │ │ │ при 20 °C │
├─────────────────────────────────┼───────────┼────┼──────────────┼───────────┤
│0,0-Диметилтиофосфорная кислота │CH O │142 │62 - 63 °C │1,5343 │
│ │ 3 \
/S │ │4,5 мм рт. ст.│ │
│ │ P/
│ │ │ │
│ │ / \
│ │ │ │
│ │CH
O OH │ │ │ │
│ │ 3
│ │ │ │
│ │ │ │ │ │
│0,0-Диэтилтиофосфорная кислота │C H O │170 │81 - 82 °C │1,5076 │
│ │ 2
5 \ /S │ │5 мм рт. ст. │ │
│
│ P/
│ │ │ │
│ │ / \
│ │ │ │
│ │C H
O OH│ │ │ │
│ │ 2
5 │ │ │ │
│ │ │ │ │ │
│0,0-Диметилдитиофосфорная кислота│CH
O │158 │ │ │
│ │ 3 \
/S │ │ │ │
│ │ P/
│ │ │ │
│ │ / \
│ │ │ │
│ │CH
O SH │ │ │ │
│ │ 3
│ │ │ │
│ │ │ │ │ │
│0,0-Диэтилдитиофосфорная кислота │C H
O │186 │97 - 98 °C │1,5105 │
│ │ 2 5 \ /S │ │2 мм рт. ст. │ │
│ │ P/
│ │ │ │
│ │ / \
│ │ │ │
│ │C H
O SH│ │ │ │
│ │ 2
5 │ │ │ │
└─────────────────────────────────┴───────────┴────┴──────────────┴───────────┘
Метаболиты ФОП практически нерастворимы в воде, растворимы в
ацетоне, диэтиловом
эфире, этилацетате, спиртах. ЛД
для белых
50
крыс диметилдитиофосфорной кислоты - 1460 мг/кг, карбофоса - 2000
мг/кг (перорально).
2. Методика
определения метаболитов ФОП, производных тио
и дитиофосфорных кислот в биологическом материале
2.1. Основные
положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на определении
алкилпроизводных тио- и дитиофосфорных кислот методом
тонкослойной и газожидкостной хроматографии после экстракции всех анализируемых
соединений из биосубстратов этилацетатом (10 мл x 3).
ТСХ-определение проводят на пластинках
"Силуфол" в подвижной фазе (ПФ) гексан:ацетон
(3:1). В качестве проявляющих реагентов использовали:
1) 4-(п-нитробензил)пиридин
+ тетраэтиленпентамин (синие пятна на белом фоне);
2) тиокетон Михлера + хлорамин (салатовые
пятна на желтом фоне);
3) 2,6-дибром-N-хлорхинонимин (красно-кирпичные пятна на белом фоне);
4) бромкрезоловый зеленый (желтые пятна
на зеленом фоне);
5) нингидрин (красные пятна на белом
фоне);
6) диметиламинобензальдегид (белые пятна
на желтом фоне).
ГЖХ-определение проводят на газовом
хроматографе "Цвет-100", снабженном термоионным детектором. В
качестве неподвижной фазы используют 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS.
Разделение данных метаболитов проводят в изотермическом режиме при T к. = 120
°C, T исп. = 160 °C.
2.1.2. Метрологическая характеристика
метода
Метрологическая характеристика метода определения
метаболитов ФОП при внесении веществ In vitro в организм и ткани животных,
мочу, кровь приведена в таблице 2.
Таблица 2
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ТСХ И ГЖХ
АЛКИЛПРОИЗВОДНЫХ ТИО- И
ДИТИОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ
В БИОСУБСТРАТАХ <*> ПРИ ВНЕСЕНИИ ВЕЩЕСТВ (P
= 0,95, N = 3)
┌───┬────────────────┬────────────────────────────┬────────────────────────────┐
│ N │
Определяемое │ ТСХ │ ГЖХ │
│п/п│ вещество
├──────┬───────┬──────┬──────┼──────┬───────┬──────┬──────┤
│ │ │нижний│среднее│относ.│довер.│нижний│среднее│относ.│довер.│
│ │ │предел│значен.│станд.│интер-│предел│значе- │станд.│интер-│
│ │ │обна-
│опреде-│откло-│вал │обна-
│ние │откло-│вал │
│ │ │руже-
│ления, │нение │сред- │руже- │опреде-│нение
│сред- │
│ │ │ния, │%
│ │него, │ния, │ления, │ │него, │
│ │ │мг/л │
│ │% │мг/л │%
│ │% │
├───┼────────────────┼──────┼───────┼──────┼──────┼──────┼───────┼──────┼──────┤
│1. │Диметилтиофос- │0,01
│68 │5,1 │2,3
│0,001 │69 │5,3 │2,4
│
│ │форная
кислота │ │ │ │ │ │ │ │ │
│2. │Диэтилтиофосфор-│0,01 │69
│4,7 │2,5 │0,001 │70 │4,6 │2,5
│
│ │ная
кислота │ │ │ │ │ │ │ │ │
│3. │Диметилдитиофос-│0,02 │71
│3,8 │1,7 │0,001 │72 │5,0 │2,5
│
│ │форная
кислота │ │ │ │ │ │ │ │ │
│4. │Диэтилдитиофос- │0,02 │70
│4,6 │2,0 │0,001 │71 │5,1 │2,4
│
│ │форная
кислота │ │ │ │ │ │ │ │ │
└───┴────────────────┴──────┴───────┴──────┴──────┴──────┴───────┴──────┴──────┘
2.1.3. Избирательность метода
Фосфорорганические пестициды не мешают
определению амилпроизводных тио- и дитиофосфорных
кислот.
2.2. Реактивы и
растворы
Этилацетат хч, ГОСТ 22300-76.
Этиловый спирт - ректификат
96-процентный, ТУ 6-09-1710-77.
Сульфат натрия хч, ГОСТ 4166-76,
безводный.
4-(п-Нитробензил)пиридин
ч, ТУ 6-09-1593-74.
Тетраэтиленпентамин ч, ТУ 6-09-8293-73.
Тиокетон Михлера.
Хлорамин.
2,6-Дибром-N-хлорхинонимин,
ТУ 6-09-0563-73.
Бромкрезоловый зеленый, ТУ 6-09-4530-77.
Нингидрин, ТУ 6-09-10-1384-79.
Диметиламинобензальдегид чда, ТУ
6-09-3272-77.
Проявляющие реактивы: N 1 - 0,2% раствор
4-(п-нитробензил)пиридина в ацетоне и 10% раствор
тетраэтиленпентамина в ацетоне; N 2 - 0,1% водный раствор хлорамина и 0,1%
метанольный раствор тиокетона Михлера; N 3 - 0,5% раствор
2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане; N 4 - 0,3% раствор бромкрезолового
зеленого в 80% метаноле смешивают с 8 каплями 30% раствора NaOH на 100 мл
раствора; N 5 - 0,25% раствор нингидрина в спирте; N 6 - 10 мл 0,25% раствора
п-диметиламинобензальдегида в этаноле смешивают перед употреблением с 1 мл
ледяной уксусной кислоты.
Ацетон хч, ГОСТ 2603-79, свежеперегнанный.
Гексан хч, ТУ 6-09-3375-78, свежеперегнанный.
Метиловый спирт хч, ГОСТ 6996-77.
Натрий гидроксид хч, ГОСТ 4328-77.
Уксусная кислота осч, ГОСТ 18270-72,
ледяная.
Неподвижная фаза: 3% OV-17 на хроматоне
N-AW-HMDCS (0,16 - 0,20 мм, Хемапол, ЧССР).
Азот
особой чистоты, содержание
O не более 0,003%, ГОСТ
2
9293-79.
Водород газообразный из баллона, ГОСТ
3022-80.
Воздух газообразный из баллона, ГОСТ
9-010-80, или нагнетаемый компрессором.
Основные стандартные растворы метаболитов
ФОП в ацетоне по 100 мкг/мл. Хранят в холодильнике 2 мес. Рабочие стандартные
растворы метаболитов ФОП, производных тио- и
дитиофосфорной кислот по 100 мкг/мл и 1 мкг/мл. Хранят в холодильнике в течение
2-х месяцев.
2.3. Приборы и
посуда
Газовый хроматограф с термоионным
детектором (ТИД) марки "Цвет-100".
Микроизмельчитель тканей РТ-2, ТУ
64-1-1505-79.
Прибор для отгонки растворителей
(ротационный вакуумный испаритель) типа ИР-1-М, ТУ 25-11-917-76 или
аналогичный.
Микрошприцы на 10 мкл, МШ-10, ТУ
5Е-2-833.024.
Механический встряхиватель, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.
Хроматографическая камера с притертой
крышкой, ГОСТ 25336-82.
Мерные колбы, ГОСТ 1770-74 на 100 и 50
мл.
Пипетки на 1, 5, 10 мл, ГОСТ 20292-74.
Пробирки с пробками на шлифах,
градуированные, ГОСТ 1770-74, на 10 мл.
Круглодонные колбы, ГОСТ 25336-82, на
100, 50 мл.
Плоскодонные колбы, ГОСТ 25336-82, на 100
мл.
Чашки Петри, ГОСТ 25336-82.
Мерные цилиндры, ГОСТ 1770-74, на 100 мл.
Делительные воронки на 100, 250 мл, ГОСТ
25336-82.
Воронки химические, ГОСТ 25336-82.
2.4. Подготовка и
определение
2.4.1. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с
"Унифицированными правилами отбора проб для определения микроколичеств
пестицидов в сельскохозяйственной продукции, продуктах питания и объектах
окружающей среды", утвержденными заместителем Главного государственного
санитарного врача СССР 21.08.1979 за N 2051-79.
2.4.2. Подготовка к определению
Хроматографические камеры за 1 час до
начала хроматографирования заполняют смесью растворителей гексан - ацетон (3:1)
для подвижной фазы. Объем подвижного растворителя в камере должен по высоте
находиться не выше чем 1 см от уровня дна камеры. Для ГЖХ-определения колонка
заполняется общепринятым в хроматографии способом, кондиционируется в течение
48 часов при температуре на 20° выше рабочей температуры колонки.
2.5. Описание
определения
2.5.1. Экстракция и очистка экстракта
Органы и ткани (печень, почки, легкие,
головной мозг)
Исследуемые органы и ткани измельчают в
микроизмельчителе тканей или на мясорубке. Отбирают 2 - 5 г средней пробы,
заливают в зависимости от взятой навески 15 - 50 мл этилацетата и оставляют на
1 час, периодически перемешивая пробу стеклянной палочкой, или ставят на 30
мин. на аппарат для встряхивания. Затем растворитель сливают в круглодонную
колбу для упаривания, фильтруя экстракт через фильтр с безводным сульфатом
натрия. Заливают пробу новой порцией растворителя и экстрагируют еще 30 мин.
Экстракт объединяют. Упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе при
температуре водяной бани 40 - 45 °C до 1 мл. Переносят остаток в мерную
пробирку со шлифом, ополаскивая колбу небольшими порциями (по 0,3 - 0,4 мл)
этилацетата. Доводят объем в пробирке этилацетатом точно до 2 мл, перемешивают
и аликвоту хроматографируют.
Кровь. 2 - 5 мл цельной крови выливают в
фарфоровую чашку. Затем прибавляют при непрерывном помешивании безводный
сернокислый натрий (20 г) и тщательно растирают пестиком. Приливают 20 - 30 мл
этилацетата и перемешивают пробу с этилацетатом в течение 10 мин. Сливают
этилацетат в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через фильтр
"красная лента". Экстракцию повторяют еще раз. Экстракты объединяют,
упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 40 - 45 °C до 1 - 2
мл. Переносят остаток в мерную пробирку и доводят объем в пробирке этилацетатом
до 2 мл. Аликвоту хроматографируют.
Моча. 20 мл мочи переносят в делительную
воронку, прибавляют 80 мл этилацетата. Осторожно встряхивают в течение 2 мин.
Дают отстояться. Отделяют верхний слой этилацетата, сливая его через
сернокислый натрий. Операцию экстрагирования повторяют дважды. Объединенные
экстракты переносят в колбу для отгонки растворителей и далее поступают, как
описано для крови.
2.5.2. Хроматографическое определение
Условия хроматографического определения
ТСХ
Остаток после концентрирования рабочей
пробы наносят с помощью капилляра на пластинку "Силуфол". Аналогичным
путем наносят серию стандартных растворов.
Хроматограмму развивают в системе гексан
- ацетон (3:1). После развития хроматограммы пластинку сушат, а затем проявляют
одним из проявляющих реагентов.
При проявлении пластин проявляющим
реагентом N 1 хроматограмму
сначала обрабатывают
0,2% раствором 4-(п-нитробензил)пиридина в
ацетоне. Затем помещают
в термостат при
температуре 110 °C в
течение 10 мин.
и обрызгивают 10% раствором тетраэтиленпентамина в
ацетоне.
Метаболиты проявляются в виде насыщенно-синих пятен на
белом фоне с
R : ДМТФ - 0,22; ДЭТФ - 0,60; ДМДТФ - 0,36; ДЭДТФ -
f
0,80. Линейный
диапазон определения 0,1 - 2 мкг.
При проявлении хроматограмм проявляющим
реагентом N 2 хроматограмму обрабатывают 0,1% водным раствором хлорамина и
через 10 мин. 0,1% раствором тиокетона Михлера в метаноле или этаноле. Зоны
локализации метаболитов обнаруживаются в виде салатных пятен на желтом фоне.
Линейный диапазон определения 0,1 - 10 мкг.
При проявлении пластин проявляющим
реагентом N 3 пластины обрабатывают 0,5% раствором 2,6-дибром-N-хлорхинонимина в гексане и нагревают 3 - 5 мин. при
температуре 110 - 140 °C. Изучаемые соединения образуют красные пятна на белом
фоне. Линейный диапазон - 1 - 20 мкг.
Проявляющий реактив N 4 готовят перед
опрыскиванием смешиванием 0,3% раствора бромкрезолового зеленого в 80% метаноле
с 8 каплями 30% раствора NaOH на 100 мл раствора. После опрыскивания тио- и дитиофосфорные кислоты проявляются в виде желтых пятен
на зеленом фоне. Линейный диапазон определения 1 - 20 мкг.
При проявлении пластинки проявляющим
реактивом N 5 10 мл 0,25% раствора нингидрина в спирте смешивают с 1 мл
концентрированной уксусной кислоты и обрабатывают пластинку. Метаболиты ФОП
проявляются в виде красных пятен на белом фоне. Линейный диапазон определения 1
- 10 мкг.
При проявлении хроматограмм проявляющим
реагентом N 6 смешивают 10 мл 0,25% раствора п-диметиламинобензальдегида в
этаноле с 1 мл ледяной уксусной кислоты и равномерно обрабатывают пластинку.
Затем помещают в сушильный шкаф, нагретый до температуры 110 °C, на 7 - 10 мин.
Метаболиты образуют белые пятна на желтом фоне.
ГЖХ
Хроматограф марки "Цвет-100" с
термоионным детектором.
Колонка стеклянная спиральная, длина 1 м,
диаметр 3 мм, заполненная 3% OV-17 на хроматоне N-AW-HMDCS (0,16 - 0,20 мм).
-10
Рабочая шкала электрометра при работе с ТИД
2 x 10 А.
Скорость протяжки диаграммной ленты 240
мм/час.
Расход газа-носителя азота 22 мл/мин.,
водорода - 14 - 17 мл/мин., воздуха - 400 мл/мин.
Температура колонки 120 °C, температура
испарителя 160 °C.
Время удерживания и пределы обнаружения
исследуемых соединений при указанных выше условиях ГЖХ-определения приведены в
таблице 3.
Таблица 3
ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ, ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ
ФОП
┌─────────────────────────┬─────┬───────────┬────────┬───────┬────────────────┐
│
Вещество │T уд.│Неподвижная│ T кол.,│T исп.,│ Нижний предел │
│ │ │
фаза │ °C │ °C │обнаружения,
мкг│
├─────────────────────────┼─────┼───────────┼────────┼───────┼────────────────┤
│0,0-диметилтиофосфорная │1,25 │3% OV-17 │120 │160 │0,02 │
│кислота │ │ │ │ │ │
│0,0-диметилдитиофосфорная│1,56 │3%
OV-17 │120 │160 │0,05 │
│кислота │ │ │ │ │ │
│0,0-диэтилтиофосфорная │2,85 │3% OV-17 │120 │160 │0,02 │
│кислота │ │ │ │ │ │
│0,0-диэтилдитиофосфорная │2,11 │3%
OV-17 │120 │160 │0,05 │
│кислота │ │ │ │ │ │
└─────────────────────────┴─────┴───────────┴────────┴───────┴────────────────┘
2.6. Обработка
результатов
Метод ТСХ
Количественное определение проводят путем
сравнения площади и интенсивности пятен рабочей пробы и серии стандартов.
Содержание метаболитов в анализируемой
пробе X в мг/кг вычисляют по формуле:
C x V
X = ------,
V x P
a
где:
C
- количество метаболита,
найденного в хроматографируемой
пробе, мкг;
V - общий объем раствора, мл;
V -
объем аликвоты, отобранный для хроматографирования, мл;
a
P - навеска пробы, г.
ГЖХ
Количественное определение проводят
методом абсолютной калибровки. Для этого до и после анализа проб вводят в
хроматограф по 3 - 5 мкл рабочих стандартных растворов (см. табл. 3). Измеряют
высоту пиков и вычисляют среднее арифметическое из 5 определений. Если при
введении в хроматограф аликвотной части (3 - 5 мкл) конечного экстракта пробы
получают слишком большие пики, пробу разбавляют ЭА. Для определения метаболитов
ФОП анализ проб следует проводить при температуре колонки (120 °C), использовав соответствующие стандарты (см. табл. 3).
Расчет результатов анализа проводят по
следующей формуле:
C x V x
H x V
ст 1
3
X = -----------------,
V x H x
P
2 ст
где:
X - содержание метаболита в пробе, мг/кг
(мг/л);
C
- количество метаболита в стандартном растворе, введенном
ст
в хроматограф,
мкг/мл;
V
- объем стандартного раствора, введенного в
хроматограф,
1
мкл;
H
- высота пика
стандартного раствора, введенного
в
ст
хроматограф, мм;
H - высота пика исследуемого раствора, мм;
V -
объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл;
2
V -
объем анализируемого экстракта, мл;
3
P - навеска или объем анализируемой пробы, г (мл).
3. Техника
безопасности
Необходимо соблюдать общепринятые правила
безопасности при работе с органическими растворителями и токсическими
веществами.