Утверждены

Министерством здравоохранения СССР

29 июля 1991 г. N 6133-91

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТАБОЛИТОВ ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ

СРЕДАХ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

(Дополнение к Методическим указаниям N 4323-87 от 08.06.87)

 

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

 

1. Краткая характеристика

 

Фосфамид (рогор, БИ-58) в организме теплокровных животных и человека образует продукты превращения:

0,0-диметил-S-карбонилметилдитиофосфат (диметоат-карбоновая кислота, температура плавления 42 °C);

    0,0-диметил-S-карбметоксиметилдитиофосфат, температура кипения

                        20

98 - 99 °C при 6,7 Па, n      = 1,5200;

                        альфа

    0,0-диметилдитиофосфорная кислота, температура кипения 52 - 55

                  20

°C при 10,66 Па, n      = 1,5340;

                  альфа

                                      20

    0,0-диметилтиофосфорная кислота, n      = 1,4800;

                                      альфа

    0,0-диметилфосфорная  кислота,  температура кипения 79 - 80 °C

              20

при 0,13 Па, n      = 1,4082.

              альфа

Указанные метаболиты могут образовываться при метаболизме других пестицидов, сходных по химическому строению с фосфамидом.

Метаболиты хорошо растворимы в органических растворителях, в том числе в ацетоне, этаноле, хлороформе, этилацетате и др.

 

2. Методика определения метаболитов фосфамида

в биологических средах (ткани внутренних органов,

кровь, моча)

 

2.1. Основные положения

 

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на экстракции метаболитов фосфамида из биологических сред органическим растворителем (хлороформ или этилацетат), очистке полученных экстрактов и последующем определении методом тонкослойной хроматографии. Хроматографирование исследуемых соединений проводят в подвижных фазах на основе ацетона, включающих малополярные и полярные растворители. Проявление на хроматограммах с помощью проявляющих реагентов: 2,6-дибром-N-хлорхинонимина, а также 4-(п-нитробензил)пиридина с последующей обработкой тетраэтиленпентамином.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 1.

 

Таблица 1

 

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МЕТАБОЛИТОВ ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ

 

┌──────────────────────────────┬─────────────┬───────┬──────────────┬──────────┐

│     Метаболиты фосфамида     │  Минимально │Нижний │Аналитическая │Примечание│

│                              │детектируемое│предел │открываемость │          │

│                              │  количество │обнару-│              │          │

│                              │             │жения, │              │          │

│                              │             │мкг/мл │              │          │

├──────────────────────────────┼─────────────┼───────┼──────────────┼──────────┤

│Метаболит N 1                 │1 мкг        │0,5    │80,5 +/- 8,5% │ткани     │

│(0,0-диметил-S-               │             │       │              │внутренних│

│карбонилметилдитиофосфат)     │             │       │              │органов   │

│                              │             │0,04   │82,0 +/- 10,8%│моча      │

│                              │             │1,0    │80,5 +/- 10,0%│кровь     │

├──────────────────────────────┼─────────────┼───────┼──────────────┼──────────┤

│Метаболит N 2                 │5 мкг        │5,0    │78,5 +/- 12,5%│кровь     │

│(0,0-диметилфосфорная кислота)│             │0,2    │80,5 +/- 11,8%│моча      │

│                              │             │2,5    │78,9 +/- 10,3%│ткани     │

├──────────────────────────────┼─────────────┼───────┼──────────────┼──────────┤

│Метаболит N 3                 │2 мкг        │1,0    │81,5 +/- 12,5%│ткани     │

│(0,0-диметилтиофосфорная      │             │2,0    │79,5 +/- 10,5%│кровь     │

│кислота)                      │             │0,08   │82,8 +/- 8,5% │моча      │

├──────────────────────────────┼─────────────┼───────┼──────────────┼──────────┤

│Метаболит N 4                 │1 мкг        │0,5    │82,4 +/- 12,5%│ткани     │

│(0,0-диметилдитиофосфорная    │             │1,0    │80,5 +/- 10,5%│кровь     │

│кислота)                      │             │0,04   │85,5 +/- 10,0%│моча      │

├──────────────────────────────┼─────────────┼───────┼──────────────┼──────────┤

│Метаболит N 5                 │1 мкг        │0,5    │82,9 +/- 8,5% │ткани     │

│(0,0-диметил-                 │             │1,0    │79,6 +/- 9,5% │кровь     │

│карбметоксиметилдитиофосфат)  │             │0,04   │85,4 +/- 10,6%│моча      │

└──────────────────────────────┴─────────────┴───────┴──────────────┴──────────┘

 

Примечание: в модельные опыты вносили по 10, 20, 50, 100 мкг исследуемых веществ. Количество опытов 60 (P = 0,05).

 

2.1.3. Избирательность метода

В условиях двумерной хроматографии после I хроматографирования из указанной выше смеси метаболитов + фосфамид раздельно определяются фосфамид, "диметоат-карбоновая кислота" и 0,0-диметилкарбметилдитиофосфат, а после II хроматографирования раздельно определяются 0,0-диметилфосфорная кислота и (или) 0,0-диметилтиофосфорная кислота (или 0,0-диметилдитиофосфорная кислота).

Последние две кислоты, если не присутствуют одновременно в пробе, отличаются окраской зоны локализации при взаимодействии с 2,6-дибром-N-хлорхинонимином.

Определению не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе (с учетом технологии возделывания с/х культур), - диазинон, циклоат, эптам, метоксихлор, линдан.

 

2.2. Реактивы и растворы

 

0,0-Диметил-S-карбонилметилдитиофосфат ("диметоат-карбоновая кислота", метаболит N 1).

0,0-Фосфорная кислота хч (метаболит N 2).

0,0-Диметилтиофосфорная кислота хч (метаболит N 3).

0,0-Диметилдитиофосфорная кислота хч (метаболит N 4).

0,0-Диметилкарбометоксиметилдитиофосфат (метаболит N 5).

Фосфамид хч или товарная форма пестицида (40-процентный или 38-процентный концентрат эмульсии).

Ацетон хч, ГОСТ 2603-79.

Бензол хч, ГОСТ 5955-75.

н-Гексан ч, ТУ 6-09-3375-78.

Хлороформ хч, ТУ 6-09-4263-76.

Уксусная кислота хч, ГОСТ 61-75.

Дистиллированная вода.

Натрий сернокислый безводный чда, ГОСТ 4166-76.

2,6-Дибром-N-хлорхинонимин, ТУ 6-09-05-63-73, хч, 0,5-процентный раствор в гексане.

4-(п-Нитробензил)пиридин, ТУ 6-09-15-93-74.

Тетраэтиленпентамин, ТУ 6-09-05-804-78.

Этилацетат хч, ГОСТ 22300-76.

Натрий лимоннокислый чда, ГОСТ 22280-78, 5% раствор.

Подвижные фазы:

I хроматографирование: N 1 - бензол - этилацетат - ацетон (60:15:25), N 2 - гексан - ацетон - хлороформ (1:1:3) и N 3 - бензол - этилацетат - уксусная кислота (50:25:25:2).

II подвижная фаза: ацетон - вода - этилацетат (4:6:2).

Проявляющие реагенты:

N 1 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин, 0,5-процентный раствор в н-гексане;

N 2 - а) 4-(п-нитробензил)пиридин, 2-процентный раствор в ацетоне, б) тетраэтиленпентамин, 10-процентный раствор в ацетона.

Стандартные растворы исследуемых метаболитов и фосфамида в хлороформе или этилацетате с содержанием вещества 100 мкг/мл. Если стандартный раствор фосфамида готовят из препаративной формы пестицида, то учитывают его процентное содержание в препарате. Срок хранения стандартных растворов до 1 месяца в холодильнике.

 

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

 

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб, ТУ 25-11-917-76, или аналогичный аппарат для отгонки растворителей.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Колбы мерные, цилиндры, ГОСТ 1770-74.

Термостат.

Пипетки, микропипетки, ГОСТ 20292-74.

Стаканы, склянки химические емкостью 50 - 100 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные, ГОСТ 25336-82.

Колбы грушевидные, ГОСТ 25336-82 (для отгонки растворителей).

Камера для хроматографирования, ГОСТ 25336-82.

Камера для опрыскивания пластинок, ГОСТ 25336-82.

Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 25336-82.

Баня водяная, ТУ 64-12350-76.

Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки.

Хроматографические пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 или 20 x 20 см.

Линейка, планиметр, миллиметровая бумага.

Измельчитель тканей, МРТУ 42-1505-63 или аналогичный.

 

2.4. Проведение определения

 

2.4.1. Экстракция и очистка экстрактов

Ткани внутренних органов (печень, почки, легкие, селезенка, сердце)

Измельченную пробу тканей внутренних органов массой 2 г помещают в склянку с притертой пробкой и приливают 10 мл охлажденного ацетона или этилацетата и встряхивают на холоде в течение 30 - 40 минут. Затем растворитель отделяют от пробы, фильтруя его через безводный сернокислый натрий (2 - 3 г) в колбу для отгонки растворителей.

Экстракцию повторяют еще дважды, используя свежие порции растворителя. Объединенный экстракт отгоняют при температуре 40 - 50 °C до объема раствора примерно 0,5 мл. Остаток раствора подсушивают безводным сернокислым натрием.

Кровь. Пробу крови 0,5 - 1 мл вносили в пробирку, смоченную раствором лимоннокислого натрия, и приливали 10 мл хлороформа. Экстрагировали на холоде в течение 30 мин. Хлороформ отделяли от пробы, фильтровали через безводный сернокислый натрий (1 - 2). Экстракцию повторяли еще дважды, используя по 5 мл хлороформа, в течение 10 и 5 минут. Объединенные экстракты вносили в колбу для отгонки растворителей.

Пробу крови можно поместить в ступку, куда насыпается 10 г безводного сернокислого натрия и растирается в течение 5 минут. Приливается 15 мл этилацетата и перемешивается содержимое ступки 20 минут. Этилацетат отделяется от массы и фильтруется через фильтр в колбу для отгонки растворителей. Сюда же фильтруются вторая и третья порции экстрагента (по 10 мл, экстракция по 5 минут). Растворитель отгоняется на ротационном испарителе при температуре 45 - 50 °C до остатка примерно 0,5 мл. Если остаток получился мутным, то его подсушивают безводным сернокислым натрием. Затем количественно переносят на хроматографическую пластинку.

Моча. 25 мл исследуемой мочи помещают в колбу с притертой пробкой, приливают 2 - 5 мл хлористого натрия и 10 мл хлороформа или этилацетата. Осторожно встряхивают в течение 30 минут (1 экстракция), 10 минут (2 и 3 экстракции). Органический растворитель отделяют от пробы, объединяют и пропускают через слой безводного сернокислого натрия (до 10 г). Переносят растворитель в колбу для отгона растворителей и отгоняют его до объема 0,5 мл при температуре 70 °C (50 °C). Если необходимо, остаток подсушивают безводным сернокислым натрием. Количественно переносят на хроматографическую пластинку.

2.4.2. Хроматографирование

    Пробу  0,5  мл  количественно  переносят на хроматографическую

пластинку,  нанося  ее  на  высоте 5 см от нижнего края пластинки.

Слева  и  справа  от  пробы  наносят  смеси  стандартных растворов

фосфамида  и  его  метаболитов N 1 - 5, содержащие по 1, 2, 5 и 10

мкг   каждого   вещества.   Помещают   пластинку   в   камеру  для

хроматографирования,  куда  за 30 - 50 минут наливают одну из трех

подвижных   фаз   для   I   хроматографирования.  После  окончания

хроматографирования (высота подъема растворителей подвижной фазы 9

-  10  см) и после улетучивания следов растворителей на расстоянии

1,5  см от линии старта (по высоте) проводят горизонтальную линию,

параллельную  линии  старта, и  отрезают  верхнюю часть пластинки.

Обрабатывают ее одним  из  проявляющих  реагентов, N 1 или 2. Если

применяют  ПР  N  1,  то  после  опрыскивания пластинку помещают в

термостат при температуре 110 - 120 °C на 2 - 3 минуты. Фосфамид и

метаболиты  N  1  и N 5 проявляются в виде красно-кирпичного цвета

пятен,  метаболиты  N  2, 3, 4 остались на нижней части пластинки.

Если   используют  ПР  N  2,  то  сначала  обрабатывают  пластинку

раствором   4-(п-нитробензил)пиридина,  помещают  на  10  минут  в

термостат    при   110   °C,   а   затем   опрыскивают   раствором

тетраэтиленпентамина.  Исследуемые  вещества  проявляются  в  виде

синих  пятен. Фосфамид и метаболиты N 1 и N 5 в подвижной фазе N 1

имеют R , равное 0,44, 0,51, 0,96 соответственно, в подвижной фазе

       f

N  2 - 0,39, 0,28, 0,92, в подвижной фазе N 3 - 0,54, 0,66, и 0,92

соответственно.

    Нижнюю  часть пластинки поворачивают на 90 °C и наносят справа

от пробы 2 или три стандартных раствора метаболитов N 2, N 3, N 4.

Проводят  II  хроматографирование в подвижной фазе ацетон - вода -

этилацетат  (4:6:2). После поднятия фронта растворителя на 10 см и

улетучивания  следов  подвижной   фазы  обрабатывают одним из двух

проявляющих реагентов, как описано выше.  Величина  R  метаболитов

                                                     f

N 2, N 3,  N  4  равна  0:0,50  и  0,50. Если метаболиты N 3 и N 4

находятся   одновременно   в  пробе,  то  они  будут  определяться

суммарно,  если  же  они не присутствуют одновременно, то их можно

идентифицировать  по  окраске  пятна:  метаболит N 3 имеет желтого

цвета пятна, а N 4 - кирпично-коричневого.

 

2.5. Обработка результатов анализа

 

Содержание метаболитов и фосфамида на хроматограммах проб определяют путем сравнения интенсивности окрашивания пятен и их площади на хроматограммах проб и стандартных растворов. Площадь пятен измеряют с помощью планиметра или промасленной миллиметровой бумаги. Содержание вещества на хроматограмме может быть определено с помощью денситометра.

Для расчета содержания исследуемых веществ в биопробе используют формулу, в которую вносят площадь пятна на хроматограмме стандарта, наиболее близкую по размерам к площади пятна на хроматограмме пробы.

Расчет концентрации исследуемого вещества в биопробе проводят по формуле:

 

                          C   x S   x V

                           ст    пр    2

                      X = --------------,

                           S   x V  x P

                            ст    1

 

    где:

    X - концентрация исследуемого вещества в пробе, мкг/мл, мкг/г;

    C   - концентрация вещества на хроматограмме стандарта, мкг;

     ст

    S   - площадь пятна на хроматограмме стандарта, кв. мм;

     ст

    S   - площадь пятна на хроматограмме пробы, кв. мм;

     пр

    V  - хроматографический объем пробы, мл;

     1

    V  - общий объем пробы, мл;

     2

    P - навеска пробы, г (или объем, мл).

 

3. Требования безопасности

 

Необходимо соблюдать все требования безопасности при работе в химической лаборатории с ядовитыми веществами и электронагревательными приборами.