Утверждаю
Начальник Главного
санитарно-эпидемиологического
управления Министерства
здравоохранения СССР
А.ПАВЛОВ
25 октября 1968 г. N 760а-68
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРИМЕНЕНИЮ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)
ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ СТОЛБНЯЧНОГО МИКРОБА В ОБЪЕКТАХ
ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ <*>
--------------------------------
<*> Инструкция подготовлена
сотрудниками ордена Трудового Красного Знамени Института эпидемиологии и
микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи
АМН СССР Т.И. Сергеевой, К.И. Матвеевым и Т.И. Булатовой.
Метод обнаружения столбнячного микроба с
помощью реакции непрямой гемагглютинации является высоко
специфичным и может быть применен в лабораториях санэпидстанций,
больниц, научно-исследовательских институтах как вспомогательный метод
исследования с целью установления обсемененности предметов внешней среды при
проверке запыленности больничных помещений, проверке на стерильность
перевязочного материала и др.
I. Объекты и цели
исследования
Исследование на наличие столбнячного
микроба производится в следующих случаях:
а) при изучении краевой эпидемиологии
столбняка с целью установления степени обсемененности Cl.
tetani почвы, пыли, растений и других объектов
внешней среды;
б) при проведении плановых
санитарно-гигиенических анализов на запыленность больничных помещений: палат,
перевязочных, предоперационных, операционных, родильных и детских отделений, а
также при проверке на стерильность перевязочных материалов, кетгута, шелка,
лекарственных средств и т.п.;
в) при анализе материалов от больных с
целью подтверждения диагноза и от трупов - для постмортального
заключения.
II. Взятие проб для
исследования
1. Пробы почвы берутся в стерильные
бактериологические пробирки с резиновыми пробками. Пробы
почвы следует брать на расстоянии трех - пяти метров друг от друга в населенных
пунктах (дворы, скотные дворы, огороды, сады, дороги, улицы, детские и
спортивные площадки и т.д.), а также в лугах, полях, пастбищах, лесах, на
берегах рек.
Для взятия почвы пробирка извлекается из
стерильного бумажного пакета, нижней частью пробирки сдвигается поверхностный
слой почвы в 3 - 5 см, затем открытым концом пробирки путем винтообразного
движения вглубь набирается почва, после чего плотно закрывается <*>. На
пробирке делают надпись: место взятия почвы, номер пробы, дата. Листья,
растения и другие объекты помещаются в стерильную посуду.
--------------------------------
<*> Применение шпаделей
для снятия поверхностного слоя почвы затруднено, так как требуется на каждую
пробу стерильный шпадель.
2. Для взятия пыли в помещениях
необходимо заготовить тампоны из ваты на палочке, смочить тампоны
физиологическим раствором, вложить их в пробирки, закрыть пробирки резиновыми
пробками и простерилизовать в автоклаве. Взятие пыли производится следующим
образом: тампоны извлекают за кончик палочки из пробирки и влажным тампоном
собирают пыль с поверхности предметов, после чего опять помещают в пробирку,
которая закрывается пробкой и надписывается.
Для анализа перевязочные средства,
образцы кетгута, шелка, лекарств направляются в заводской упаковке или же из
них делается выборочное взятие стерильными инструментами тампонов, марлевых
салфеток, ваты и других материалов, которые помещаются в стерильную посуду с
надписью, содержащей название материала, место взятия и дату.
3. При подозрении на столбняк от больных
берут на исследование содержимое раны, отторгнутые ткани, инородные тела,
извлеченные из ран, перевязочные средства (тампоны, дренажные трубки, кетгут,
шелк и т.д.). При криминальных абортах следует брать тампоном выделения из
шейки матки. В случае подозрения на столбняк у новорожденного необходимо взять
на исследование ткани из пупочной ранки, тампоны, повязки, шелк, использованные
для перевязки пуповины. От трупов следует брать кусочек мышечной ткани из
предполагаемого места внедрения инфекции и содержимое раны. Для взятия
материала на исследование применяются стерильные инструменты и посуда. Пробы этикетируются, где указывается название материала, фамилия,
имя, отчество больного или трупа, дата взятия. Все пробы до исследования должны
храниться при температуре не выше 4°.
III. Посев
исследуемых материалов
Исследование всех вышеуказанных
материалов производится путем посева их на жидкую среду и дальнейшего исследования
культуральной жидкости посевов с помощью реакции
непрямой гемагглютинации (РНГА).
Для посевов используется бульон Глузмана
или бульон Вейнберга с кусочками мяса под вазелиновым
маслом при рН 7,2 - 7,4, разлитые по 70 мл во флаконы емкостью 100 мл.
Перед посевом флаконы со средой
прогревают на водяной бане при 100° в течение 10 минут для регенерации среды,
после чего охлаждают до 45°.
В каждый флакон перед посевом добавляют
по 0,5% стерильного 40% раствора глюкозы (1 мл на флакон).
Посев почвы производится следующим
образом: в пробирку с пробой почвы добавляют равный объем физиологического
раствора, после чего почва тщательно перемешивается пастеровской пипеткой,
спустя 40 - 60 минут выдерживания при комнатной температуре по 2 - 3 мл
почвенной суспензии вносится во флакон со средой.
Тампон с пылью извлекают за палочку из
пробирки, осторожно отделяют его пипеткой от палочки и целиком помещают в
питательную среду. Листья, растения и другие предметы помещают стерильным
пинцетом во флакон со средой.
Перевязочные и другие материалы,
проверяемые на стерильность, исследуют в специальных стерильных боксах и одежде
с соблюдением правил асептики. Приблизительно по 2 - 3 гр. материала (тампоны,
бинты, вата, кетгут, шелк и т.д.) извлекают стерильными инструментами и
помещают в среду.
Кусочки тканей, взятые из трупов,
предварительно измельчаются, а затем вносятся в питательную среду; содержимое
раны, тампоны и другие материалы от больных засеваются так же, как указано
выше.
Все посевы помещают в термостат при 37°.
При наличии роста исследование посевов следует начинать спустя 48 часов после
посева.
Посевы материалов, подвергавшихся
стерилизации (перевязочные средства, кетгут, шелк), необходимо при отсутствии
видимого роста выдерживать в термостате до 2-х недель. Трех - четырехсуточные
посевы испытуемых материалов исследуются методом реакции непрямой
гемагглютинации (РНГА) и микроскопированием.
IV. Материалы и
реактивы, необходимые для постановки РНГА
Для постановки РНГА необходимы следующие
реактивы и материалы:
1) Реактивы для приготовления буферных
растворов:
1/15 М NaHPO 2H O
4 2
1/15 М KH PO
2 4
физиологический раствор
2) Танин
3) Противостолбнячная сыворотка,
очищенная и концентрированная методом "Диаферм-3" активностью 1000 -
1500 АЕ в 1 мл
4) Бараньи эритроциты (нативные, консервированные в растворе Олсвера
или формалинизированные эритроциты)
5) Нормальная кроличья сыворотка
6) Столбнячный очищенный,
концентрированный, но не адсорбированный анатоксин, активностью 150 - 200 ЕС в
1 мл
7) Доски для гемагглютинации из
плексигласа с 72 лунками. Объем лунки 2 мл
8) Шприц непрерывного действия на 1 мл
9) Пипетки
градуированные на 1, 2, 5 мл.
Приготовление
буферных растворов
Для приготовления 1 литра 1/15 М Na HPO 2H O
раствора берется 11,88
2 4 2
г реактива и добавляется до 1 литра физиологический раствор.
Для приготовления 1 литра
1/15 М KH PO
раствора берется 9,08 г
2 4
реактива и
добавляется до 1 литра теплый (45°) физиологический раствор. Из
этих исходных
растворов готовятся буферные растворы для постановки РНГА.
Буфер с рН 6,4
┐
1/15 М Na HPO 2H
O - 61,1 мл │
2
4 2 │ 100 мл
1/15 М KH PO - 38,9 мл │
2
4 ┘
Буфер с рН 7,0
┐
1/15 М Na HPO 2H
O - 53,4 мл │
2
4 2 │ 240 мл
1/15 М KH PO - 186,6 мл│
2
4 ┘
Для получения большего количества
буферных растворов составные части увеличивают в нужное число раз. Буферные
растворы изготовляют заранее, контролируют их рН и сохраняют при 4 - 10°.
Приготовление
раствора танина
Для танизирования
эритроцитов используется медицинский порошкообразный танин. Рабочим разведением
танина является разведение его в физиологическом растворе в соотношении
1:20000.
Сначала готовят исходный раствор танина,
который можно сохранять в холодильнике при 4 - 10° в течение 2 - 3-х недель и
использовать для работы.
Для приготовления исходного раствора
взвешивают на торсионных или аналитических весах 10 - 12 мг танина и помещают в
пробирку, куда добавляют физиологический раствор до концентрации 1 мг/мл, в
результате чего получают разведение танина 1:1000. Для получения разведения 1:20000
исходный раствор разводят в 20 раз (1 мл исходного раствора + 19 мл
физиологического раствора).
Противостолбнячная сыворотка
"Диаферм-3" должна быть первоначально апробирована в РНГА со
столбнячным анатоксином или токсином, так как не всякая серия сыворотки бывает пригодна для сенсибилизации эритроцитов. Методика
проверки сыворотки изложена ниже.
Бараньи эритроциты
Для РНГА лучше использовать эритроциты,
консервированные в растворе Олсвера, которые при
хранении в холодильнике могут быть применены для РНГА в течение 3 - 4-х недель.
Раствор Олсвера
для консервации эритроцитов:
1) Глюкоза - 2,05 г
2) Лимоннокислый Na
- 0,8 г
3) Хлористый Na
- 0,42 г
4) Дистиллированная вода - до 100 мл.
Установить рН - 6,1 - 6,2, стерилизовать
2 раза по 30 минут текучим паром. Кровь из барана берется в стерильную посуду с
раствором Олсвера в соотношении 1:1.
Для РНГА можно использовать также формалинизированные эритроциты и танизированные
по методу М.И. Леви (1962, 1967), которые в течение нескольких месяцев
сохраняют свои свойства.
V. Методика
постановки реакции
Приготовление танизированных эритроцитов
По 3 - 5 мл нативных
или консервированных эритроцитов барана отмывают 4 - 5 раз физиологическим
раствором в центрифуге при 2500 - 3000 об./мин. по 5 - 7 минут. Прозрачную бесцветную надосадочную жидкость сливают, по 0,15 мл осадка отмытых
эритроцитов помещают в центрифужные пробирки, куда
вносят 4 мл физиологического раствора и 4 мл рабочего разведения танина
(1:20000), смесь выдерживают при 37° в течение 10 минут и отмывают:
а) смесь центрифугируют 5 - 7 минут при
3000 об./мин., надосадочную жидкость сливают;
б) осадок отмывают физиологическим
раствором 2 раза.
Сенсибилизация
эритроцитов противостолбнячной
сывороткой
К осадку отмытых танизированных
эритроцитов добавляют 3 мл противостолбнячной сыворотки, разведенной 1:10
буферным физиологическим раствором с рН - 6,4. Смесь выдерживают при 37° в
течение 1 часа, после чего отмывают на центрифуге:
а) центрифугируют 5 - 7 минут при 3000 об./мин., надосадочную
жидкость сливают;
б) осадок отмывают 4 мл буферного
физиологического раствора с рН 6,4, надосадочную
жидкость сливают;
в) осадок отмывают буферным
физиологическим раствором рН 6,4 с 1% нормальной инактивированной при 56° 30
минут кроличьей сывороткой, надосадочную жидкость
сливают;
г) осадок суспендируют
в 6 мл буферного раствора рН 6,4 с 1% нормальной инактивированной кроличьей
сывороткой - получается 2,5% взвесь танизированных
сенсибилизированных противостолбнячной сывороткой эритроцитов.
Сенсибилизация танизированных формалинизированных
эритроцитов производится следующим образом: 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов
отмывают физиологическим раствором, к осадку добавляют противостолбнячную
сыворотку в указанном количестве, смесь выдерживают в термостате 2 часа, после
чего отмывают, как указано выше, и взвешивают в 5 мл физиологического раствора
с pH 6,4 и 1% нормальной кроличьей сывороткой
(инактивированной).
Разведение
исследуемого материала
Из посевов исследуемого материала на жидкие питательные среды спустя 48 часов
инкубации при 37° берут по 0,5 мл культуральной
жидкости, делают мазок на предметном стекле для микроскопирования,
а затем разводят в 5 раз буферным физиологическим раствором рН 7,0 и 0,4%
нормальной кроличьей инактивированной сывороткой (1:250).
Во все лунки доски для гемагглютинации
разливают по 0,5 мл буферный раствор рН 7,0 с 0,4% кроличьей сыворотки. В 1-ю
лунку вносят 0,5 мл разведенной в 5 раз культуральной
жидкости, далее делают последовательные 2-кратные разведения исследуемого
материала путем переноса из лунки в лунку по 0,5 мл смеси, из предпоследней
лунки 0,5 мл выливают, последняя лунка остается для контроля. Таким образом получают разведения испытуемой культуральной
жидкости от 1:10 до 1:10240 <*> (схема 1).
--------------------------------
<*> При апробации
противостолбнячных сывороток таким же образом разводят столбнячный анатоксин
или столбнячный токсин.
Схема 1
|
|
1:10
|
1:20
|
1:40
|
1:80
|
1:160
|
1:320
|
1:640
|
1:1280
|
1:2500
и т.д.
|
Контр.
|
|
N 1
|
0,5 мл
исход-
ного
разве-
дения
|
0,5 мл
|
0,5 мл
|
и т.д.
|
|
|
|
|
|
0,5 мл
|
|
N 2
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,5 мл
|
|
N 3
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,5 мл
|
|
N 4
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,5 мл
|
|
N 5
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,5 мл
|
|
N 6
|
0,5 мл
столб.
анато-
ксина
или
токси-
на
|
0,5 мл
|
0,5 мл
|
и т.д.
|
|
|
|
|
|
0,5 мл
|
В первую лунку каждого из 5
горизонтальных рядов вносят исходные разведения пяти исследуемых культур (N 1 -
5). В 6-й ряд вносят 0,5 мл столбнячного анатоксина или токсина и разводят так
же (контроль активности сенсибилизированных эритроцитов). После приготовления
разведений испытуемого материала в каждую лунку, включая и контрольные, вносят
по 0,1 мл взвеси танизированных сенсибилизированных
сывороткой эритроцитов. Содержимое лунок тщательно перемешивают путем
осторожного встряхивания, и доски помещают в термостат на 1 час при 37°, а
затем оставляют при комнатной температуре. Предварительный учет результатов
реакции производят через 2 - 3 часа, окончательный через 18 часов.
Учет результатов
Учет результатов производится визуально
по следующей схеме:
(+) - положительная реакция: равномерная
агглютинация эритроцитов, лунка заполнена гомогенной розовой взвесью;
(+/-) - учитываемая крайняя положительная
реакция: зона агглютинированных эритроцитов несколько
меньше диаметра лунки и окружена красным тонким ободком эритроцитов;
(-) - отрицательная реакция: зона
эритроцитов занимает половину или менее диаметра лунки и окружена плотным
красным ободком или представляет собой плотный красный диск
("пуговка"), лежащий на дне лунки.
За положительный результат следует считать (+) или (+/-) реакцию в разведении 1:20 и выше испытуемого
материала (т.е. во 2-й и последующих лунках горизонтального ряда доски), при
отрицательном контроле в вертикальном 12-м ряду и положительном - в 6-м
горизонтальном ряду в разведении не менее 1:1280 - 1:2560 <*>.
--------------------------------
<*> При контроле противостолбнячных
сывороток следует отбирать для работы те серии сывороток, которые дают
положительный результат в РНГА с анатоксином или токсином в разведении не менее
чем до 1:2560 - 1:5120.
Мазки, приготовленные из каждого
исследуемого посева, фиксируют над пламенем, окрашивают по Граму
и микроскопируют. Наличие в препарате
грамположительных палочковидных микробов со спорами в виде барабанной палочки при положительной РНГА с данным посевом указывает на наличие
возбудителей столбняка в исследуемом материале.
При наличии в препарате микробов, похожих
на Cl. tetani, и
сомнительной реакции гемагглютинации необходимо повторить РНГА на 5 - 6-е сутки
выращивания посевов, а также поставить биологическую пробу на белых мышах.
Для этого нужно развести испытуемую культуральную жидкость в 5 раз и ввести по 0,5 мл двум
белым мышам в мышцу задней лапки. Появление признаков столбняка (напряжение
хвоста и конечности на стороне введения, изгибание позвоночника, судороги) у
мыши свидетельствует о наличии столбнячного микроба.
При выделении чистой культуры с целью
идентификации столбнячного микроба путем посева на высокий столбик высевы
отдельных колоний на жидкую среду следует проверять также по указанной
методике.