Утверждены
Министерством
здравоохранения РСФСР
22 октября 1970 г. N 06-5476
ПИЩЕВЫЕ ОТРАВЛЕНИЯ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ BAC. CEREUS,
И ИХ ДИАГНОСТИКА
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Пищевые отравления бактериальной природы
составляют объект особой заботы органов здравоохранения. Количество заболеваний
этой группы практически не снижается, и при этом этиологический фактор в 30 -
60% случаев (по статистике разных лет) остается неустановленным. Это в
значительней степени объясняется тем обстоятельством, что ряд микроорганизмов,
широко фигурирующих в качестве возбудителей пищевых отравлений в отдельных
странах мира, в нашей стране до последнего времени не изучался или изучался
недостаточно. Соответственно, не делалось никаких эпидемиологических выводов и
не проводилось профилактических мероприятий в отношении пищевых отравлений,
связанных с данными микроорганизмами.
К числу таких микроорганизмов, изучение
роли которых при пищевых отравлениях в нашей стране начато лишь в последние
годы, относится Bac. cereus. В то же время, по данным отдельных авторов, в
таких странах, как Швеция, Венгрия, ФРГ, Югославия и др. этот микроорганизм в
качестве причины пищевых отравлений занимает в указанных странах одно из первых
мест. Случаи пищевых отравлений, вызванных Bac. cereus, описаны практически во
всех странах Европы, а также в Канаде и Японии. Все вышеизложенное привлекает к
данному микроорганизму внимание все большего и большего числа исследователей.
Настоящее Методическое руководство
составлено на основании пятилетнего опыта работы группы
сотрудников кафедры общей гигиены 2-го МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова по
комплексному изучению вопросов, связанных с выявлением возможности пищевых
отравлений, вызываемых Bac. cereus, в нашей стране.
Бактериологическая
характеристика Bac. cereus
Bac. cereus был
открыт в 1888 году Франкландом, а позднее описан под целым рядом других
наименований (Bac. pseudoentracis, Bac. antacoides, Bac. ellenbachi, Bac. C и т.д.), некоторые из них до настоящего времени
довольно широко фигурируют в литературе и даже в учебных руководствах.
По современной классификации Bac. cereus отнесен к роду Bacittus, к группе апатогенных аэробных
спорообразователей. Род Bacittus объединяет 25 видов, из которых два - Bac.
thuringiensis и Bac. mycoides, очевидно, следует рассматривать как варианты
Bac. cereus, ибо первый вообще от него не отличим, а второй отличается лишь
ризоидным характером роста на твердых питательных средах, однако и это
свойство, как показали исследования последних лет, может стойко утрачиваться.
В мазках чистой культуры с поверхности
косого агара, окрашенных по Грамму, Bac. cereus имеет вид группных,
грамположительных палочек со слегка закругленными концами, лежащих в виде
цепочек или штакетообразных скоплений, реже - отдельно друг от друга. В висячей
капле он подвижен, однако могут встречаться штаммы со слабо выраженной
подвижностью (около 15%) и даже вовсе лишенные подвижности (около 0,5%). Штаммы
со слабо выраженной подвижностью и неподвижные штаммы чаще встречаются у Bac.
cereus var mycoides.
На поверхности мясопептонного агара Bac.
cereus образует крупные распластанные колонии белого цвета со слегка
изрезанными краями. На средах с желтком эти колонии окружены широкой зоной
глубокого белого равномерного матового коагулята (положительная реакция на
лецитиназу). На среде Мосселя колонии Bac. cereus зернистой консистенции
розового цвета, зона коагулята также розового цвета. На полимиксиновых средах с
ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый) колонии Bac.
cereus зернистые, матовые, ярко-рубинового цвета на фоне зоны белого коагулята.
На кровяном агаре колонии Bac. cereus сероватой окраски,
зернистые - в отраженном свете, с перламутровым отливом - в проходящем свете,
окружены зоной гемолиза разной интенсивности.
На столбике косого агара Bac. cereus дает
сплошной белый рост, иногда мучнистого вида. Рост этого микроорганизма на
жидких питательных средах сопровождается помутнением бульона, образованием
хлопьевидного осадка белого цвета (у 25 - 30% штаммов) и нежной пленки белого
цвета на поверхности среды. Все штаммы Bac. cereus створаживают молоко,
частично пептонизируя его на 6 - 10 сутки. Около 85% штаммов разжижают желатину
в течение 1 - 2 (20% штаммов) - 3 - 4 суток.
Все без исключения штаммы Bac. cereus
дают положительную реакцию на лецитиназу (по наличию зоны коагулята на средах с
желтком) и реакцию на ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра) разной
интенсивности. От 5 до 20% штаммов Bac. cereus разного происхождения растут на
цитратной среде Козера. Штаммы Bac. cereus расщепляют при 30
°С до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов - также сахарозу
(около 80%), декстрин (30%), лактозу (10%), галактозу (около 1%), инулин и
дульцит (около 0,5%).
Оптимум роста для Bac. cereus - 30 °С, однако споры его могут прорастать при широком интервале
температур от 3 - 5° до 70 °С и давать рост при 6 - 55 °С (около 4% штаммов);
при температуре 12 - 39 °С достаточно интенсивный рост дают все штаммы данного
микроорганизма. Bac. cereus способен давать рост в широком интервале pH от 4 до
12,5 (около 30% штаммов), в интервале же pH 7 - 9,5 интенсивный рост дают все
без исключения штаммы этого микроорганизма.
Достаточно устойчив
Bac. cereus и к действию поваренной соли и других посолочных солей, сахара,
коптильных препаратов. Поваренная соль задерживает размножение этого
микроорганизма лишь при 10 - 15-процентном содержании; сахар - при
20-процентном содержании, а нитриты и коптильные препараты в применяемых
концентрациях практически не оказывают влияния на размножение Bac. cereus в
продуктах питания.
Bac. cereus легко и быстро образует
споры. Содержание спор обычно уже в двухсуточной культуре составляет до 50% от
общего числа клеток данного микроорганизма. При этом споры Bac. cereus обладают
достаточно высокой температурной устойчивостью и могут выживать не только при
обычных методах технологической обработки пищи (варка, обжаривание, кипячение),
но и при стерилизации молока и консервов.
Вопрос о токсинообразовании Bac. cereus
до настоящего времени окончательно не решен, однако установлено, что штаммы
этого микроорганизма постоянно вырабатывают гемолизин и лецитиназу, а также
коллагеназу, ряд протеаз и гиалуронидазу. Наличие в составе токсина Bac. cereus
перечисленных антигенов может вызывать летальность у белых мышей (около 40%
штаммов данного микроорганизма) при внутривенном введении центрифугатов
суточных культур на мясопептонном бульоне.
Благодаря способности вырабатывать
пенициллиназу большинство штаммов Bac. cereus абсолютно не чувствительно к
пенициллину и его полусинтетическим препаратам (оксациллину, клоксациллину и в
меньшей мере метициллину). Низкой чувствительностью обладают штаммы Bac. cereus
и к полимиксину, более выраженной - к ристомицину, стрептомицину, мономицину, террамицину,
тетрациклину и неомицину, высокой - к биомицину, канамицину и антибиотикам
смешанного состава; очень высокой чувствительностью - к левомицетину,
эритромицину и олеандомицину.
Особенностью штаммов Bac. cereus,
выделенных при пищевых отравлениях, является более высокая биохимическая
активность (выраженный гемолиз, лецитиназная реакция, реакция на
ацетилметилкарбинол, протеолитическая активность), высокая термоустойчивость
спор и более выраженная устойчивость к большинству антибиотиков.
Распространение во
внешней среде
Bac. cereus принадлежит к числу
микроорганизмов, чрезвычайно широко распространенных в природе. Основной средой
его обитания является почва, где он наряду с другими споровыми аэробами
принимает участие в разрушении органических веществ сложного
состава, как бы завершая процесс минерализации. Bac. cereus и его вариант Bac.
mycoides являются наиболее распространенными представителями этой группы
микроорганизмов. В то же время содержание Bac. cereus в почве зависит от
содержания в ней органических веществ. Bac. cereus лучше развивается в почвах с
нейтральной и слабощелочной реакцией, что естественно сказывается на частоте
обнаружения его в таких почвах, а также на количественной характеристике его
содержания. Имеются данные о том, что количество Bac. cereus в почве возрастает
по мере продвижения с севера на юг, достигая максимума в средней полосе и
снижаясь в почвах южных республик нашей страны. В почвах центральной полосы
Bac. cereus содержится в количествах до десятков тысяч в 1 г.
Обнаружение Bac. cereus в воде
расценивается обычно как результат вымывания данного микроорганизма из почвы. В
этом объекте внешней среды содержание Bac. cereus также достаточно велико. Этот микроорганизм почти постоянно обнаруживается в воде открытых
водоемов в количествах до тысяч и даже десятка тысяч в 1 л. Почти в половине
проб обнаруживается он и в водопроводной воде, причем титры Bac. cereus в
водопроводной воде значительно ниже таковых для кишечной палочки, что
объясняется низкой эффективностью применяемых методов обеззараживания, в
частности, хлорирования, в отношении споровых форм микроорганизмов.
Широкое распространение Bac. cereus в
почве способствует тому, что этот микроорганизм при запылении воздуха
загрязняет последний. Сама история открытия данного микроорганизма связана с
выделением его из воздуха коровника. В пыли, осажденной в течение суток на
поверхность в 100 кв. см, содержание Bac. cereus может достигать десятков тысяч
спор. Выделение этого микроорганизма из воздуха, очевидно, в значительной степени
связано с его запыленностью, которая, в свою очередь, зависит от влажности,
скорости движения, наличия людей в помещении и т.д. Так, в
воздухе, имеющем влажность 40 - 60%, при скорости движения 0,1 - 0,2 м/сек. в
отсутствие людей этот микроорганизм выделяется в 10 - 15% случаев в количествах
десятков спор из 1 куб. м. При аналогичных параметрах микроклимата и большом
скоплении людей (в раздаточных залах столовых, в коридорах общественных зданий
и т.д.) этот процент возрастает до 30, а количество спор микроорганизма
достигает нескольких сотен в 1 куб. м.
Широкое
распространение Bac. cereus в почве, воде и воздухе помещений, естественно,
может приводить к обсеменению этим микроорганизмом оборудования и аппаратуры
предприятий пищевой промышленности и общественного питания, где Bac. cereus
обнаруживается приблизительно в 20% случаев, в количествах сотен и тысяч со 100
кв. см. При этом прослеживается четкая зависимость между характером проводимой
обработки оборудования и его обсеменением указанным микроорганизмом.
На "грязном" оборудовании он
встречается в 4 - 5 раз чаще и в количествах на 1 - 2 логарифмических порядка
выше, чем на оборудовании, подвергнутом обработке современными
моюще-дезинфицирующими веществами (препарат "Прогресс", катионат-10 и
т.д.).
Широкое распространение Bac. cereus на
перечисленных объектах внешней среды, а также носительство этого микроорганизма
насекомыми, у которых он вызывает целый ряд заболеваний, создают предпосылки к
обсеменению Bac. cereus продуктов питания.
Обсеменение Bac.
cereus продуктов питания
Bac. cereus довольно часто обнаруживается
на самых разнообразных продуктах питания. В зависимости от происхождения и
характера (химического состава, кислотности, стадии обработки и т.д.) продукты
питания могут содержать Bac. cereus от 1 - 2% до 60% в количествах от десятков
до сотен тысяч в 1 г (мл).
Наиболее высокий процент обсеменения Bac.
cereus отмечается в группе молочных продуктов (около 30%). При этом довольно
значительно отличается частота выделения этого микроорганизма из различных
продуктов, представляющих данную группу. Самый большой процент обсеменения
отмечается обычно у пастеризованного молока (до 60%) и топленого молока (35 -
40%). Из сырого молока, очевидно, в силу конкурентного действия сопутствующей
микрофлоры, Bac. cereus выделяется значительно реже (в 10 - 15%), а в
молочнокислых продуктах он, как правило, вообще не обнаруживается.
Второе место по частоте обнаружения Bac.
cereus занимают концентраты, где этот микроорганизм обнаруживается в 20 - 25%
случаев. При этом более часто данный микроорганизм обнаруживается в
концентратах, содержащих жир и животные белки (молочно-овощные,
молочно-крупяные, мясо-овощные и мясо-крупяные
концентраты), что связано, очевидно, с характером используемого для их
изготовления сырья, а также защитным действием жира и белка на споры Bac.
cereus в процессе изготовления концентратов. Массивность обсеменения
концентратов данным микроорганизмом может достигать сотен и тысяч в 1 г.
Весьма часто Bac. cereus выделяется из
консервированных продуктов (в 15 - 20% случаев). Наиболее часто он
обнаруживается в мясо-крупяных консервах (до 40%),
консервах "Рыба натуральная" и "Рыба в масле" (в 20 - 25%).
В этих консервах обычно обнаруживаются и наибольшие количества Bac. cereus (до
тысяч и даже десятков тысяч в 1 г, против десятков сотен в 1 г в других видах
консервов). Несколько реже Bac. cereus обнаруживается в мясо-растительных
консервах (около 15%), а в мясных, овощных, фруктовых консервах и консервах
"Рыба в томате" частота обнаружения этого микроорганизма обычно не
превышает 8 - 10%.
Следующее по частоте обнаружения Bac.
cereus место (около 10%) занимает группа продуктов растительного происхождения.
Однако сравнительно низкий средний процент обсеменения продуктов данной группы
не позволяет с полной объективностью характеризовать их эпидемиологическую
опасность, ибо в обсеменении Bac. cereus продуктов растительного происхождения
отмечаются чрезвычайно большие колебания. Наиболее часто этот микроорганизм
обнаруживается на сырых овощах (более 50% случаев) в количествах до десятков
тысяч на 1 г. Овощные полуфабрикаты обсеменены Bac. cereus в 15 - 16% случаев,
а на готовых овощных блюдах этот микроорганизм встречается только в 4 - 6%
случаев. Массивность обсеменения Bac. cereus готовых овощных блюд обычно не
превышает сотен в 1 г, однако в холодных овощных блюдах (салаты, винегреты),
длительно хранившихся до реализации, Bac. cereus может содержаться в
количествах десятков и даже сотен тысяч в 1 г.
Наиболее низкий процент обсеменения Bac.
cereus отмечается в группе мясных продуктов. Средний процент обнаружения этого
микроорганизма на мясе и мясных продуктах составляет 8%, однако и здесь
отмечаются довольно значительные колебания. Мясо в тушах свежезабитых животных
в зависимости от организации забоя, оснащенности забойных пунктов и их
санитарного уровня обсеменено Bac. cereus от 0,5% до 3%. Процент обсеменения
этим микроорганизмом мороженых туш несколько выше (около 5%). Резкое увеличение
обсемененности мяса Bac. cereus (более чем в 2 раза) отмечается в процессе
дефростации. Мясные полуфабрикаты обсеменены этим микроорганизмом в 7 - 9%
случаев. Массивность обсеменения Bac. cereus мяса и сырых
мясных изделий обычно не превышает сотен в 1 г. Готовые мясные блюда обсеменены
Bac. cereus довольно редко (около 2% случаев), однако в силу резкого снижения
общего микробного обсеменения на этих блюдах Bac. cereus может быстро
размножаться, следствием чего является обычно более высокий уровень их
обсеменения данным микроорганизмом (до тысяч и более в 1 г). Мясные
изделия длительного срока хранения (колбасы и др.) имеют более высокий (до 10%)
процент обсеменения Bac. cereus.
Очевидно, обсеменение самых разнообразных
продуктов питания связано с их вторичным загрязнением в процессе заготовки,
разделки, изготовления и хранения за счет объектов внешней среды. Первичное
обсеменение в силу отсутствия носительства этого микроорганизма у животных,
очевидно, не имеет места.
Достаточно высокий процент обсеменения
Bac. cereus различных продуктов питания и низкая требовательность данного
микроорганизма к условиям, необходимым для размножения, создают предпосылку к
размножению Bac. cereus в продуктах, что, в свою очередь, может привести к
возникновению пищевых отравлений. При этом эпидемиологическую опасность могут
представлять все без исключения продукты питания. Не случайно в описанных до
настоящего времени случаях пищевых отравлений, вызванных Bac. cereus,
фигурируют самые разнообразные продукты питания животного, растительного и
смешанного происхождения.
Пищевые отравления,
вызываемые Bac. cereus
Первые указания на возможность пищевых
отравлений, вызванных аэробными спорообразующими бациллами, появились еще в
начале нашего столетия. Еще в 1906 году Лубенау описал в Германии случай
гастроэнтерита примерно у 300 отдыхающих санатория после употребления
"битков по-кенигсбергски". Из продукта, вызвавшего заболевание, была
выделена аэробная спорообразующая бацилла, отнесенная автором к группе
мезентерикус-субтилис. При этом автор указал, что выделенный микроорганизм
обладал высокой гемолитической способностью. Последнее обстоятельство дало
основание Никодемусу (Венгрия, 1962) ретроспективно отнести данный
микроорганизм к Bac. cereus.
Первые несомненные данные о роли Bac.
cereus в пищевых отравлениях у человека были получены Кристиансеном, Кохом и
Маделунгом в 1951 году в Швеции. Авторы изучили отравление у 121 человека (15
взрослых и 106 детей) после употребления пудинга, обсемененного чистой
культурой Bac. cereus. Начиная с этого момента указания на причинную роль Bac.
cereus в пищевых отравлениях у человека стали появляться в печати ежегодно,
причем охватывая все большее количество стран. В период с 1955 по 1957 год в
Норвегии и Дании (Хауге - 1955, Кларенбург и Кампельмахер - 1957) описано более
800 случаев заболеваний данной этиологии, причем причиной отравления являлись
картофельное пюре, пудинг и крем.
Характер продуктов, с которыми были
связаны первые вспышки пищевых отравлений, вызванных Bac. cereus, позволил
авторам, описавшим их, считать, что отравления в связи с этим микроорганизмом
могут вызвать лишь продукты растительного происхождения, содержащие большое
количество крахмала. Однако еще в 1952 году было описано в Италии (Пизу и
Стацци) отравление куриным бульоном, содержащим 60 млн. Bac. cereus в 1 мл. В
последующие годы описаны отравления, вызванные копченой колбасой и птицей
(Боднар - 1962), беконом (Жуллотти и Спано - 1962), жареной свининой (Херал -
1963), ливерной колбасой (Темпер - 1963), жареной рыбой в томатном соусе (Смукал
и Рокочевская - 1965), колбасами, консервированной уткой, тушеной говядиной
(Пивоваров и др. - 1969, 1970). В этот же период имели место и отравления,
связанные с растительными продуктами или продуктами смешанного происхождения, -
пудингом (Бишофф - 1962, Зайдель и Шульц - 1963), первыми блюдами, гарнирами
(Пивоваров и др. - 1969, 1970). Никодемус, являющийся автором
или соавтором большинства описанных в Венгрии пищевых отравлений, вызванных
Bac. cereus, за пятилетний период наблюдения приводит следующую статистическую
подборку (1962). Из 51 вспышки отравлений данной этиологии 23 были
вызваны продуктами растительного происхождения, 15 - животными продуктами и 13
- смешанными. Анализ описанных к настоящему моменту вспышек пищевых отравлений,
вызванных Bac. cereus, показывает, что на долю продуктов растительного
происхождения приходится около 40% вспышек, животного происхождения - 35% и
продуктов смешанного происхождения - 25% от общего числа зарегистрированных
отравлений. Большая частота отравлений, вызванных Bac. cereus в связи с
растительными продуктами, объясняется, очевидно, большим уровнем загрязнения
данных продуктов указанным микроорганизмом, более щадящими режимами их
кулинарной обработки, менее строгим подходом к режимам хранения этих продуктов,
а также неприхотливостью Bac. cereus к условиям, необходимым для размножения.
Пищевые отравления, вызванные Bac.
cereus, в большинстве случаев протекают сравнительно легко. После
инкубационного периода порядка 4 - 16 часов появляются боли в животе схваткообразного
характера, тошнота (примерно в 30% случаев), диарея до 10 - 20 раз в сутки.
Стул жидкий, без примесей или с примесью слизи. Температура, как правило, не
повышается или повышается незначительно. Продолжительность заболевания 11 - 16,
реже - 24 - 48 часов. Такие легкопротекающие случаи пищевых отравлений обычно
не попадают в поле зрения клинических врачей и замыкаются, в лучшем случае, на
уровне участкового врача или врача медико-санитарной части предприятия. Поэтому
такие заболевания практически диагностируются очень редко и
лечение не проводится, да и больные в нем, как правило, не нуждаются.
Вместе с тем в отдельных случаях пищевые
отравления, вызванные Bac. cereus, могут отличаться более тяжелым и
продолжительным течением, и больные в этих случаях нуждаются в своевременной
диагностике и лечении, ибо, хотя и крайне редко, но отравления данной этиологии
могут оканчиваться летальным исходом (Темпер - 1963). Тяжелопротекающие случаи
пищевых отравлений, вызванных Bac. cereus, обычно сопровождаются выраженными
симптомами общей интоксикации (слабость, головокружение, головная боль,
тошнота, рвота, нарушение сердечной деятельности, иногда кратковременная потеря
сознания и тянущие боли в конечностях). В этих случаях, как правило,
наблюдается повышение температуры до 36 - 39°, увеличение печени и селезенки,
умеренный лейкоцитоз и ускорение РОЭ. Стул многократный (до 15 - 20 и более раз
за сутки), водянистый, с примесью слизи, а иногда и с прожилками крови. При
ректороманоскопии отмечается гиперемия и отечность слизистой кишечника.
Продолжительность заболевания при таких случаях отравлений до 5 - 10 дней.
Анализ литературных данных и наших наблюдений показывает, что тяжелопротекающие
пищевые отравления, вызванные Bac. cereus, составляют около 2% от общего числа пищевых
отравлений данной этиологии.
В литературе неоднократно описаны и
пищевые отравления смешанной этиологии, вызванные продуктами, обсемененными
Bac. cereus в сочетании с другими микроорганизмами: Bac.
cereus и Cl. perfringens (Адам - 1958), Bac. cereus и патогенные коли, Bac.
cereus и Staph. aureus (Никодемус и Чаба - 1959) и др. Особый интерес
представляет возможность возникновения пищевых отравлений, связанных с
совместным действием Bac. cereus и токсинов стафилококка, ибо, по имеющимся
литературным данным (Мак Коу и Фабер - 1966), при совместном размножении в
продуктах питания Bac. cereus способен активизировать накопление
энтеротоксина стафилококка.
До
настоящего времени нет
твердо установившегося мнения в отношении
патогенеза пищевых отравлений, вызываемых Bac. cereus.
Большинство авторов
относит эти
отравления к токсикоинфекциям, основываясь на клинике этих
отравлений, а
также на постоянно
высоком уровне обсеменения
данным
5
микроорганизмом продуктов, вызвавших отравление (10 в 1 г и выше). Вместе
с тем
предложен и ряд
других теорий патогенеза
данного заболевания.
Некоторые авторы (Темпер -
1962, Бибик - 1961, Мияки и др. - 1954, Шонберг
и Конекамп
- 1962) рассматривают
данное заболевание как
результат
воздействия на
организм продуктов расщепления
белка под влиянием
протеолитических ферментов,
вырабатываемых Bac. cereus.
Несколько иной
точки зрения на природу данного заболевания
придерживаются Нигрен (1962) и
Плисская (1965).
Они считают, что
клиника заболевания данной этиологии
связана с локальным
воздействием на кишечник фосфорилхолина - продукта
расщепления лецитина.
Наиболее оправданной представляется
токсикоинфекционная
природа пищевых отравлений, вызванных Bac. cereus, хотя
воздействие токсических
продуктов расщепления, очевидно,
также нельзя
сбрасывать со
счета. Вполне возможно, что именно то или иное содержание
этих компонентов
может обусловливать разное
по тяжести течение пищевых
отравлений,
вызванных Bac. cereus.
Анализ литературных данных и наши
наблюдения показывают, что Bac. cereus несомненно
играет значительную роль при пищевых отравлениях у людей. На долю отравлений
данной этиологии приходится до 5% от общего числа пищевых отравлений. Широкие
исследования в масштабе всей страны будут способствовать сокращению числа
пищевых отравлений, этиологический фактор которых остается неустановленным, и
приведут к разработке мероприятий по профилактике этой группы заболеваний.
Поэтому исследования на Bac. cereus должны быть включены в общую схему
бактериологического анализа при расследовании всех без исключения случаев
пищевых отравлений.
Диагностика
Первоначально при расследовании случаев
пищевых отравлений в качестве диагностического критерия использовали выделение
Bac. cereus из подозреваемого продукта питания в количествах, превышающих сотни
тысяч в 1 г. Попытки выделить этот микроорганизм из faeces больных длительное
время успеха не имели. Лишь после 1962 года, когда Никодемусом была предложена
спиртово-желточная среда для выделения Bac. cereus, этот микроорганизм стали
почти постоянно выделять из кишечного содержимого людей в случаях пищевых
отравлений, связанных с данным микроорганизмом. В последние годы установлено
(Ю.П. Пивоваров - 1968, 1969, 1970), что здоровое бациллоносительство Bac.
cereus - явление крайне редкое. Из faeces здоровых людей он
выделяется лишь в 0,5% случаев в количествах - 10 - 100 клеток в 1 г. В то же
время при пищевых отравлениях, вызванных Bac. cereus, этот микроорганизм
постоянно выделяется из кишечного содержимого больных в острый период
заболевания в количествах тысяч и десятков тысяч в 1 г и исчезает из faeces лишь
к моменту выздоровления.
В соответствии с
изложенным диагноз пищевого отравления, вызванного Bac. cereus, может быть
поставлен, если при отсутствии патогенной микрофлоры:
1.
Bac. cereus выделен из подозреваемого продукта
питания в количестве
5
10 /г и выше;
2. Bac. cereus выделен
параллельно из кала и рвотных масс или промывных
2
вод желудка в
количестве 10 /г и выше;
3.
Bac. cereus выделен из
кала большинства пострадавших
при
расследуемой
вспышке отравления;
4. Bac. cereus выделен только из кала в острый период
заболевания (в
2 3
количестве 10 -
10 в 1 г и выше) с последующим исчезновением этого
микроорганизма
из кишечного содержимого к моменту выздоровления.
Естественно, что последние три
диагностических критерия следует использовать главным образом в тех случаях,
когда получить для бактериологического исследования подозреваемый продукт
питания в силу каких-либо причин не удается. Для
подтверждения диагноза могут быть использованы серологические реакции, в
частности нарастание титра реакции агглютинации с кровью переболевших по
сравнению с таковыми в начале заболевания (в качестве антигена следует
использовать штамм, выделенный при данной вспышке), однако, учитывая обычно
непродолжительное течение заболевания при отравлениях данной этиологии,
постановка таких реакций мало осуществима, да и не имеет большого практического
значения.
Для выделения Bac. cereus был предложен
ряд питательных сред. Первоначально, когда этот микроорганизм изучался главным
образом как почвенный микроорганизм, для выделения его использовался обычный
желточный агар или кровяной агар. Однако проведение широких исследований по
изучению этиологической роли данного микроорганизма при пищевых отравлениях у
человека потребовало разработки новых питательных сред, позволяющих выделять
данный микроорганизм из сильно загрязненных микрофлорой объектов, например, из
faeces и продуктов питания. Предложен ряд питательных сред, характеристика
которых по основным показателям представлена в таблице 1.
Таблица 1
ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ BAC.
CEREUS
|
Наименование
среды
|
Для каких
исследо-
ваний
предназ-
начена
|
Морфология
колоний
Bac. cereus
|
Время
роста
(в
часах)
|
Рекомен-
дуемое
время
подсчета
колоний
|
|
Желточный
агар
|
Почва
|
Крупные белые
распластанные
колонии со слегка изрезанными
краями, окруженные широкой
зоной глубокого белого равно-
мерного матового коагулята
|
12 - 20
|
18 - 24
час.
инкуба-
ции при
30 °С
|
|
Среда
Донован
|
Молочные
продукты
|
-"-
|
16 - 24
|
24
|
|
Среда Чистовича
|
faeces
|
-"-
|
48 - 72
|
72
|
|
Среда Никодемуса
|
faeces,
продукты
питания,
почва и
др.
|
-"-
|
24 - 96
|
72
|
|
Полимиксиновый
агар (Ю.П. Пиво-
варов, 1970)
|
Продукты
питания,
почва
|
-"-
|
12 - 24
|
24
|
|
Среда
Мосселя
|
Продукты
питания
|
Зернистые колонии
розового
цвета, окруженные зоной
коагулята такого же цвета;
среда бесцветная или со
слабо-розовой окраской
|
16 - 24
|
24
|
|
Солевой полимик-
синовый агар с
ТТХ (Ю.П. Пиво-
варов, 1970)
|
faeces,
продукты
питания,
почва и
др.
|
Ярко-рубиновые
колонии на
фоне широкой зоны глубокого
равномерного белого коагуля-
та; колонии в первые часы
роста округлые, выпуклые, в
дальнейшем (25 - 48 час.) -
распластанные по поверхности
агара с изрезанными краями
|
16 - 48
|
48
|
Из приведенных сред лишь две (среда
Никодемуса и солевой полимиксиновый агар) могут быть использованы для
исследования всех без исключения объектов. Для исследования продуктов питания
могут быть рекомендованы: среда Мосселя и среда Донован (последняя в
особенности для исследования молочных продуктов). Среда Никодемуса позволяет
выделять Bac. cereus из материалов, имеющих очень большую обсемененность
другими микроорганизмами, однако на ней растут далеко не все штаммы Bac. cereus
(на этой среде прорастает и дает рост лишь около 10% спор Bac. cereus,
находящихся в исследуемом объекте). Недостатком данной среды является и
значительная задержка роста на ней данного микроорганизма, что замедляет
исследования. Поэтому при расследовании случаев пищевых
отравлений целесообразно использовать для посевов на Bac. cereus солевой
полимиксиновый агар с ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый), на котором вырастают
почти все штаммы данного микроорганизма, а предварительный ответ о наличии Bac.
cereus может быть дан уже спустя сутки с начала исследования. Среда
Чистовича (агар с 8 - 10-процентным содержанием поваренной соли) также
позволяет выделять Bac. cereus из сильно загрязненного микрофлорой материала,
однако на этой среде дают рост лишь 1 - 5% спор данного микроорганизма. Что
касается других сред, представленных в таблице, то использовать их для
выделения Bac. cereus из faeces практически не представляется возможным, ибо
бурно развивающаяся сопутствующая микрофлора препятствует размножению данного
микроорганизма. В то же время эти среды могут быть использованы при посеве
предварительно прогретого материала.
Первичный посев разведений исследуемого
объекта производится на агаризованные питательные среды согласно данным таблицы
2. После равномерного распределения посевного материала чашки с посевом
подсушиваются и затем инкубируются при 30 °С (срок
инкубации в зависимости от используемой среды - таблица 1). Оставшаяся часть
разведений материала прогревается, засевается и инкубируется согласно той же
схеме. Подозрительные колонии (морфология колоний Bac. cereus
приведена в таблице 1) пересеваются на косой столбик мясопептонного агара и
инкубируются сутки при 30 °С. Идентификация Bac. cereus производится на
основании наличия подвижности (в висячей капле), положительной реакции на
лецитиназу (по наличию зоны коагулята на средах с желтком) и положительной
реакции на ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра). В качестве
дополнительных тестов может изучаться сахаролитическая активность (Bac. cereus
не расщепляет маннит) и гемолитическая активность (Bac. cereus дает гемолиз
разной интенсивности на средах с кровью барана, кролика, человека и др.).
Таблица 2
СХЕМА ПОСЕВА МАТЕРИАЛА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ НА BAC.
CEREUS
|
Объект
исследования
|
Разведение
посевного материала
|
|
1 х 10
|
1 х 100
|
1 х 1000
|
1 х 10000
|
|
Продукты питания
|
Посевная
доза в мл
|
-
|
-
|
1,0
|
1,0
|
1,01
|
|
faeces
|
1,0
|
1,0
|
-
|
-
|
-
|
|
Рвотные
массы
|
1,0
|
1,0
|
-
|
-
|
-
|
|
Промывные
воды
желудка
|
1,0
|
1,0
|
-
|
-
|
-
|
Количественный учет Bac. cereus
производится по количеству выросших на чашках типичных колоний с пересчетом на
засевавшееся на данную чашку разведение исследовавшегося объекта.
Рецепты питательных
сред
Основой для приготовления твердых
питательных сред, предназначенных для выделения Bac. cereus, может служить
любой 2,5-процентный питательный агар.
Желточный агар. К 500 мл стерильного
агара, расплавленного, а затем охлажденного до 45 °С,
прибавляют эмульсию двух яичных желтков (в 10 мл физ. р-ра). Смесь тщательно
перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике.
Среда Никодемуса. К 500 мл стерильного
агара, расплавленного, а затем охлажденного до 45 °С,
прибавляют 40 мл этилового спирта и после перемешивания - эмульсию двух яичных
желтков. Смесь тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри. Хранение в
холодильнике не более 3 - 5 дней.
Полимиксиновая среда. К 500 мл
стерильного, расплавленного и затем охлажденного до 45 °С
питательного агара прибавляют 200000 или 400000 ед. полимиксина (т.е. из
расчета 400 и 800 ед./мл) и эмульсию двух яичных желтков. Смесь тщательно
перемешивают и разливают по чашкам Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
Желточно-солевая среда с полимиксином и
ТТХ. К 500 мл стерильного питательного агара с 6-процентным содержанием
поваренной соли, расплавленного и затем охлажденного до 45 °С,
прибавляют 100000 или 200000 ед. полимиксина (200 или 400 ед./мл) 0,005%,
трифенилтетразолия хлористого и эмульсию двух яичных желтков. Смесь тщательно
перемешивают и разливают по чашкам Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
Среда Донован (модификация). К 500 мл
питательного агара прибавляют 2,5 г трехзамещенного цитрата натрия, 2,5 г
хлористого лития. Агар стерилизуется при 110 °С 30
минут. После охлаждения до 45 °С в него добавляются
100000 ед. (200 ед./мл) полимиксина и эмульсия двух яичных желтков. Смесь
тщательно перемешивается и разливается по чашкам Петри. Хранение в холодильнике
7 - 10 дней.
Среда Мосселя (модификация). К 500 мл
питательного агара прибавляют 5 г маннита, 12,5 мг фенолового красного.
Стерилизуют в автоклаве при 110 °С 30 минут. После
охлаждения до 45 °С добавляют 100000 ед. (200 ед./мл)
полимиксина и эмульсию двух яичных желтков. Тщательно перемешивают и разливают
по чашкам Петри. Хранение в холодильнике 5 - 7 дней.
Примечание. Среды Донован и Мосселя
модифицированы для упрощения их рецептуры и возможности использования
отечественных препаратов при изготовлении.