Утверждаю

Заместитель Министра

здравоохранения СССР

Главный государственный

санитарный врач СССР

П.Н.БУРГАСОВ

5 марта 1974 г. N 1150-74

 

ИНСТРУКТИВНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОБНАРУЖЕНИЮ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

БАКТЕРИАЛЬНОЙ И ВИРУСНОЙ ПРИРОДЫ В ВОДЕ

 

В подготовке инструктивно-методических указаний принимали участие:

Институт общей и коммунальной гигиены им. А.Н. Сысина АМН СССР, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана МЗ РСФСР, Центральный институт усовершенствования врачей, Центральный институт эпидемиологии МЗ СССР, Московский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Московская городская санитарно-эпидемиологическая станция.

 

I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

 

Современный уровень коммунального благоустройства большинства городов гарантирует эпидемическую безопасность водопроводной воды. Это в значительной степени способствовало снижению общей заболеваемости в стране кишечными инфекциями. Наряду с этим до настоящего времени вода в распространении некоторых кишечных заболеваний, в частности, брюшного тифа, холеры и других является одним из ведущих путей. В последние годы все большее место в инфекционной патологии человека занимают вирусные инфекции, для которых также возможен водный путь распространения (полиомиелит, ЕСНО, Коксаки, эпидемический гепатит).

Передача кишечных инфекций с водой может быть обусловлена недостаточной очисткой или обеззараживанием питьевой воды на некоторых водопроводных станциях, а также широким неорганизованным использованием для хозяйственно-питьевых и других бытовых целей воды открытых водоемов, загрязняемых сточными водами, в особенности сточными водами инфекционных больниц.

В связи с широким развитием большой химии в стране наблюдается значительный рост объема промышленных сточных вод, что приводит к загрязнению воды открытых водоемов и снижению процессов самоочищения в них. Снижение активности антагонистического биоценоза воды и большое распространение антибиотикоустойчивых форм патогенных бактерий семейства кишечных приводит к более длительной циркуляции возбудителей инфекций в воде.

Увеличение степени микробного загрязнения водоемов, являющихся источниками централизованного или неорганизованного питьевого, хозяйственно-бытового водоснабжения, создает потенциальную опасность более широкого распространения кишечных инфекций.

Для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий, а также для разработки и выполнения санитарно-гигиенических рекомендаций по неспецифической профилактике кишечных инфекций бактериальной и вирусной природы, передаваемых с водой, возрастает роль и значение микробиологического контроля за качеством воды: питьевой, воды открытых водоемов и сточных вод. С этой целью кроме учета общепринятых бактериологических показателей (общее количество, титр кишечной палочки) в ряде случаев возникает необходимость непосредственного обнаружения в воде возбудителей кишечных инфекций.

Исследование воды на наличие патогенных микроорганизмов рекомендуется проводить:

1. Питьевой воды:

- по эпидемическим показаниям;

- при обнаружении титра кишечной палочки ниже стандарта.

2. Воды открытых водоемов:

- по эпидемическим показаниям;

- при выборе источника централизованного водоснабжения;

- при выборе места для строительства санаториев, домов отдыха, пионерских лагерей, детских оздоровительных учреждений, городских пляжей на берегу рек, озер, прудов.

3. Сточной воды:

- при оценке эффективности работы очистных сооружений городской канализации;

- при оценке эффективности обеззараживания выделений больных в инфекционных больницах;

- при проведении широких обследований сточных вод для обнаружения источников инфекции среди населения канализованного микрорайона города, рабочего поселка и т.п.

При исследовании относительно чистой в микробном отношении питьевой водопроводной воды на наличие патогенных микроорганизмов необходимо концентрировать искомую микрофлору, содержащуюся в ничтожно малом количестве в воде. Обнаружение возбудителей кишечных инфекций в воде открытых водоемов и сточных водах на фоне преобладающей массы сапрофитной микрофлоры наиболее эффективно при концентрировании искомых бактерий в средах накопления, которые угнетают рост сопутствующей микрофлоры. Следовательно, при проведении анализа воды, имеющей различную степень общего микробного загрязнения, используют определенные методы выделения патогенной микрофлоры.

Выделенные из воды в естественных условиях возбудители бактериальных кишечных инфекций могут иметь отклонение от типичных по разным признакам: морфологическим, биохимическим и серологическим, могут обладать пониженной вирулентностью, но способны восстанавливать типичные свойства данного вида бактерий. При оценке качества исследуемой воды необходимо учитывать и атипичные формы патогенных бактерий, представляющие потенциальную эпидемическую опасность.

 

ОТБОР, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА ПРОБ

 

1. Пробы воды для исследования на присутствие патогенных бактерий семейства кишечных отбирают специально инструктированные лабораторные работники или санитарные врачи и их помощники.

2. Частота отбора проб устанавливается в зависимости от объема конкретно решаемых задач текущего санитарного надзора.

При отборе проб воды по эпидпоказаниям место и время отбора проб, а также кратность бактериологических исследований определяется эпидобстановкой.

3. Пробы воды отбирают в количестве 1 - 3-х литров, но не менее 500 мл, в стерильные флаконы с притертыми пробками или в бутылки.

Стерилизацию флаконов и бутылок производят сухим жаром в течение 1 часа при 160 - 170 °C. При этом флаконы закрывают притертыми пробками с бумажной прокладкой. Горлышко флаконов поверх притертых пробок закрывают бумажными колпачками и обвязывают шпагатом. Бутылки закрывают ватными пробками и бумажными колпачками и также обвязывают шпагатом.

    4. Если  отбираемая  проба  воды  содержит  или может  содержать  следы

остаточного  хлора или хлорамина,  то для  нейтрализации этих веществ перед

отбором  пробы во флаконы  емкостью 1 литр  добавляют 4 мл 1,5% стерильного

раствора тиосульфата (Na S O  x 5H O) (гипосульфит натрия).

                        2 2 3     2

5. При отборе проб непосредственно из реки, озера, водохранилища нежелательно отбирать пробу слишком близко к берегу или в отдалении от места водозабора.

Выбор точек для отбора проб производят исходя из местных условий и задач. При отборе проб воды из реки следует предусмотреть, как минимум, две точки: в месте застоя и в месте наиболее быстрого течения. Для отбора глубинных проб необходимы специальные устройства, например, батометры. Удобное приспособление для выемки проб - раскладной шест. Чаще отбор проб из реки, озер, водохранилищ производят путем погружения флакона или бутылки в воду горлышком вниз, при этом флакон или бутыль придерживают за дно. Затем бутыль переворачивают так, чтобы горлышко было направлено несколько вверх, устанавливая горлышко бутылки против течения. Если отбор проб нельзя произвести таким способом, то ко дну бутылки прикрепляют груз, что обеспечивает ее погружение в воду.

Все манипуляции по отбору проб производят осторожно, чтобы не нарушать целостность грунта у берега.

Если из водоисточника отбирается одновременно несколько проб, то в первую очередь необходимо отобрать пробу для бактериологического исследования.

6. При отборе проб сточной жидкости как на различных этапах ее очистки, так и после полного обеззараживания используют металлические черпаки на деревянных или из другого материала ручках либо бутылки, укрепленные винтовым зажимом на металлическом или деревянном стержне.

Целесообразно привлекать для отбора проб сточной жидкости специальных выемщиков из штата лабораторий очистных сооружений.

Владея определенными техническими навыками, выемщики обеспечат быструю и правильную выемку проб.

При выемке проб сточной жидкости должна соблюдаться самая тщательная чистота рук выемщика и всего инвентаря.

Выемщику необходимо иметь мыло, полотенце, денатурированный спирт для обработки рук и поверхности бутылок с отобранными пробами воды.

7. Пробы воды доставляют в лабораторию не позднее 5 часов от момента взятия пробы. При более длительных сроках транспортировки это обстоятельство отмечают в протоколе анализа.

Температура проб воды во время транспортировки должна поддерживаться на уровне возможно близком к исходному. Ватные пробки бутылок необходимо предохранять от смачивания.

Если нет возможности в день отбора пробы начать исследование, то применяют консерванты.

8. В сопроводительный документ и соответственно в лабораторный журнал заносятся следующие данные:

1. Наименование пробы воды.

2. Место нахождения объекта, из которого взята проба.

3. Кем взята проба воды (фамилия, должность).

4. По чьему заданию и с какой целью производится исследование.

5. Дата и час выемки, а также дата и час доставки пробы в лабораторию.

 

II. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ

 

1. ОБНАРУЖЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

 

а) Сальмонелл

 

Отбор проб

 

Питьевую воду отбирают в количестве 1 - 3 литров.

Воду открытых водоемов - в количестве 1 литра.

Сточную жидкость - в количестве 300 - 500 мл.

 

Посев воды в среды накопления

 

Используют не менее двух сред накопления: селенитовую, Кауфмана, магниевую или среду с охмеленным суслом.

Исследуемую воду засевают в первые три среды накопления двойной концентрации, в последнюю: на 100 мл среды - 400 мл воды. Питьевую воду и воду открытых водоемов засевают во флаконы емкостью 500 мл: - 200 мл исследуемой воды в равное количество среды накопления удвоенной концентрации.

Сточную воду засевают 100 мл в равное количество среды накопления удвоенной концентрации, 10 мл сточной жидкости засевают в 100 мл среды обычной концентрации, 1 мл сточной жидкости - в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов.

На следующий день из сред накопления производят высев на 2 - 3 чашки с висмут-сульфит агаром. Чашки с посевами инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов.

На среде висмут-сульфит агаре колонии сальмонелл круглые черные с сероватым металлическим ободком вокруг них, зеленые с темным центром и без него, вызывающие потемнение среды под колонией. С каждой чашки снимают по 4 - 5 типичных для сальмонелл колоний на среду Ресселя.

При отсутствии роста через 24 часа чашки с посевами оставляют в термостате еще на 24 часа и через 48 часов просматривают их снова. Дальнейшее исследование проводится по общепринятой методике исследования на сальмонеллы до определения серотипа.

К роду сальмонелл относят культуры грамотрицательных подвижных палочек, которые:

1. Сбраживают глюкозу и маннит с образованием или без образования газа.

2. Не ферментируют лактозу, сахарозу и не расщепляют мочевину.

3. Не образуют индола.

4. Обладают четкой серологической характеристикой, определяемой с помощью адсорбированных монорецепторных O- и H-сальмонеллезных агглютинирующих сывороток.

При выделении подобных культур дается положительный ответ.

 

б) Шигелл

 

Для выделения шигелл из воды используется среда накопления с охмеленным суслом. На 100 мл среды (см. пропись в Приложении) берут 400 мл исследуемой воды. Посев подращивают при температуре 37 °C в течение 18 - 20 часов, после чего делают посев с помощью бактериальной петли на плотные элективные питательные среды: среду Левина или среду Плоскирева. Учитывая, что в настоящее время среди шигелл преобладают антибиотикоустойчивые штаммы, рекомендуется для посева шигелл среда Левина с антибиотиком (см. пропись в Приложении). Для высева из среды накопления рекомендуется брать не менее 5 чашек с плотной питательной средой на одну пробу воды. Это повышает возможность выделения шигелл из воды.

Через сутки инкубации при 37 °C чашки просматривают и отбирают для дальнейшего исследования все подозрительные колонии: мелкие, прозрачные, бесцветные, круглые или с неровными краями. Отобранные колонии засевают на дифференциальную среду ("скошенный столбик" двухсахарного агара с мочевиной). Через сутки инкубации при 37 °C отбирают культуры грамотрицательных палочек, которые ферментируют глюкозу, не ферментируют лактозу, не расщепляют мочевину. Затем производится серологическое определение культур до вида, типа, подтипа по общепринятой схеме.

 

в) Метод исследования питьевой воды

 

Исследуемую воду фильтруют через мембранные фильтры N 3 в объеме не менее 500 мл (количество фильтров зависит от скорости фильтрации воды). После фильтрации мембранные фильтры укладывают на поверхность питательной среды Эндо, предварительно залитой в чашки Петри (поверхность фильтра, на которой осели бактерии, остается верхней). Посев подращивают три температуре 37 °C 18 - 24 часа.

После учета выросших на мембранных фильтрах колоний кишечных палочек и определения коли-титра производится вторичный посев: мембранные фильтры, на которых имелся рост мелких единичных бесцветных колоний, а также и те, на которых нет видимого бактериального роста, помещают в среды накопления, например, среду с охмеленным суслом или хлормагниевую среду (перед посевом фильтра приготовленную среду с охмеленным суслом разводят стерильной водопроводной водой 1:4). Объем среды обогащения - 50 мл.

Посев помещают в термостат на 18 - 24 часа при температуре 37 °C, после чего производят высевы на плотные дифференциально-диагностические среды: висмут-сульфитный агар, среду Левина с антибиотиком, среду Плоскирева.

Дальнейшее выделение и идентификация бактерий производится по общепринятой методике.

 

г) Оценка атипичных культур

 

При исследовании воды на наличие патогенных энтеробактерий часто выделяются атипичные формы, которые могут иметь некоторые отклонения в биохимической и серологической активности, однако, сохраняющие вирулентность, т.е. представляющие потенциальную эпидемическую опасность.

Большое количество экспериментальных исследований и изучение атипичных штаммов, выделенных из загрязненных открытых водоемов в естественных условиях, из сточных вод, позволило установить определенные критерии для оценки этих штаммов. Основным доказательством принадлежности атипичного штамма к патогенным бактериям семейства кишечных является способность реверсировать в исходную типичную форму. Восстановление происходит довольно быстро, после 3 - 4 пересевов на плотные и жидкие питательные среды (желчный бульон, мясо-пептонный агар, двухсахарные дифференциальные среды и др.). Практически это происходит уже в процессе выделения чистой культуры, определения биохимической активности и серологических свойств изучаемого штамма.

При выделении культур, отклоняющихся от типичных, могут быть отмечены разновидности, имеющие типичные биохимические свойства, которые не имеют некоторых антигенов, например, брюшнотифозные палочки могут утрачивать Vi- и H-антигены, или при типичных серологических свойствах давать нехарактерные для данного вида бактерий биохимические реакции. Для дальнейшего исследования необходимо убедиться, что мы имеем дело с чистой культурой, отбирать нежные, мелкие, прозрачные колонии, не разлагающие мочевину, не пептонизирующие и не свертывающие молоко.

Для сальмонелл одним из основных показателей принадлежности к данному роду бактерий является способность лизироваться O-сальмонеллезным фагом. Наиболее частым затруднением в определении вида культуры, подозрительной на принадлежность к шигеллам, является отсутствие агглютинабельности. Такие культуры чаще всего относятся к непатогенным бактериям рода эшерихии - алкалесценс диспар и другим эшерихиям, которые или совсем не разлагают лактозу, или разлагают ее через несколько суток. Чтобы исключить принадлежность изучаемой культуры к кишечным сапрофитам, необходимо более широкое изучение биохимических, серологических свойств выделенных штаммов, а самое главное - способность сохранять вирулентность.

    Вирулентность  шигелл  определяют  по  кератоконъюнктивальной  пробе  у

морских  свинок  или  кроликов.  Вирулентность  сальмонелл определяют путем

внутрибрюшинного  заражения белых мышей,  положительным считается результат

при значении LD  , не превышающим 400 - 500 млн. микробных клеток.

               50

Для тех и других бактерий может быть применен метод определения цитопатического действия на клетки культуры ткани, широко используемый в вирусологии (см. Приложение).

 

2. ОБНАРУЖЕНИЕ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

 

Для обнаружения в воде холерных вибрионов отбирают следующие объемы воды:

а) из источника водоснабжения (места водозабора) - не менее 1 литра;

б) водопроводной воды - не менее 1 литра;

в) сточной воды - не менее 1 литра.

Отбор проб и транспортировка. Пробы воды берут в стерильные бутыли на 1 литр или по 0,5 литра с непромокаемыми пробками. Бутыли с пробами этикетируют и плотно укладывают в металлическую тару (бикс, ведро, кастрюлю и др.) и перевозят на специальном транспорте с сопровождающим. К таре с пробами прилагают сопроводительный документ, в котором указывают количество направленных проб, место и время взятия проб.

От момента взятия пробы до начала исследования должно пройти не более 3-х часов. При плановом обследовании исследование проб воды, доставленных в конце дня, можно проводить на следующий день.

Общие принципы исследования воды:

А. Непосредственный посев на среду накопления.

Б. Посев после концентрации на фильтрах.

 

Первый этап исследования

 

А. Непосредственный посев на среду накопления.

После определения pH и в случае необходимости подщелачивания 10% раствором едкого натра до pH 8,0 воду разливают в 2 колбы и к каждой из них добавляют основной раствор пептона в пропорции, необходимой для получения 1% пептонной воды. Посев инкубируют при 37 °C 5 - 6 часов. Если проведение высевов через 6 часов невозможно, к первичным посевам добавляют теллурит калия до окончательного разведения 1:100000 - 1:200000. Инкубируют при 37 °C 18 часов. При плановых исследованиях проб, доставленных в конце дня, можно после установления щелочной реакции и добавления основного раствора пептона до 1% концентрации пробы сохранять до утра при комнатной температуре (не выше 18 - 20 °C). В начале следующего дня засевают 2 - 3 мл поверхностного слоя в 100 мл 1% пептонной воды (1-я среда накопления). Инкубация при 37 °C 5 - 6 часов. Разрешается также при плановом обследовании высев 2 среды накопления на агаровые чашки производить через 12 - 16 часов.

Б. Посев после концентрации на фильтрах.

Воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или асбестовые фильтры. Фильтры с осадком засевают в среду накопления и на агаровые чашки.

 

Второй этап исследования

 

Изучение роста на 1-й среде накопления (на жидких средах холерный вибрион дает гомогенное помутнение и пленку). Пересев с 1-й среды накопления на 2-ю среду накопления и на плотные среды.

 

Третий этап исследования

 

А. Изучение роста на 2-й среде накопления. Пересев со 2-й среды накопления на плотные среды.

Б. Изучение роста на плотных средах.

Отбор подозрительных колоний и отсев на полиуглеводную среду (Ресселя, сахарозо-лактозная, Олькеницкого и др.). Изучение наиболее подозрительных колоний (микроскопия мазков, подвижность, ориентировочная реакция агглютинации), пересев на косой агар для выделения чистой культуры и ее идентификации. Идентификацию также можно проводить с молодой бульонной 3 - 4-часовой культурой.

Последующие исследования проводят по общепринятой методике, определяя серологические, биохимические свойства и лизабельность фагами.

 

ТЕСТЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ V. CHOLERAE

 

┌─────────────────────────┬───────────────────────────────────────────────┐

│         Признак         │                Характеристика                 │

│                         ├───────────────────────┬───────────────────────┤

│                         │ V. cholerae classica  │  V. cholerae El. tor  │

├─────────────────────────┼───────────────────────┼───────────────────────┤

│1. Морфология микробной  │Вибрион подвижный      │Вибрион подвижный      │

│клетки и тинкториальные  │(1 жгутик)             │(1 жгутик)             │

│свойства                 │Грамотрицательный      │Грамотрицательный      │

│2. Культуральные свойства│Растет на щелочной     │Растет на щелочной     │

│                         │среде, колонии гладкие,│среде, колонии гладкие,│

│                         │прозрачные             │прозрачные             │

│3. Ферментация           │1 группа               │1 группа               │

│углеводородов по Хейбергу│                       │                       │

│4. Агглютинабельность    │Агглютинация не менее  │Агглютинация не менее  │

│холерной сывороткой      │чем до 1/2 титра       │чем до 1/2 титра       │

│  Огави                  │+ или -                │+ или -                │

│  Инаба                  │- или +                │- или +                │

│5. Чувствительность к    │Лизируется             │Не лизируется          │

│диагностическим          │                       │                       │

│бактериофагам "C"        │                       │                       │

│  Эль Тор П              │Не лизируется          │Лизируется             │

│6. Чувствительность к    │Чувствителен           │Не чувствителен (рост) │

│полимиксину              │(нет роста)            │                       │

│(50 ед. в 1 мл среды)    │                       │                       │

│7. Реакция               │-                      │+                      │

│гемагглютинации куриных  │                       │                       │

│эритроцитов              │                       │                       │

│8. Реакция               │-                      │+ или -                │

│Фогес-Проскауэра         │                       │                       │

│9. Гемолиз бараньих      │-                      │- или +                │

│эритроцитов              │                       │                       │

└─────────────────────────┴───────────────────────┴───────────────────────┘

 

3. ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

 

Лабораторная работа по выделению и дифференциации палочек сибирской язвы из любого исследуемого материала должна проводиться в условиях, предупреждающих возможность инфицирования персонала и обсеменения возбудителями объектов внешней среды, в строгом соответствии с "Инструкцией по режиму работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителем чумы, холеры, сапа, миелоидоза, натуральной оспы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза", утвержденной Министерством здравоохранения СССР 21 июня 1967 г.

Для обнаружения возбудителя сибирской язвы на объектах внешней среды, в частности, в воде, применяют сигнальные и заключительные методы исследования.

К физическим методам концентрирования относятся центрифугирование, фильтрование через мембранные фильтры. Центрифугирование проводят в течение 15 мин. при 2000 - 3000 об./мин. При фильтровании используют мембранные фильтры N 3.

С целью биологического концентрирования используют подращивание B. anthracis на питательных средах и введение их лабораторным животным.

Воду для исследования берут в количестве 1 литра, половину ее (500 мл) равными порциями (пропускают через 4 мембранных фильтра N 3 без предварительного прогревания. Методы обработки мембранных фильтров даны в Приложении.

Для люминесцентно-серологического выявления вегетативных клеток после подращивания два фильтра засевают на чашки с 0,7% МПА путем накладывания мембранного фильтра на питательную среду вверх поверхностью, через которую фильтровали исследуемый материал. С двух мембранных фильтров делают смыв в стерильных чашках Петри, нанося на их поверхность 1 мл физиологического раствора. Смыв используют для посева на среду ГКИ (см. Приложение), введения белым мышам и выявления спор люминесцентно-серологическим методом.

Вторую порцию воды прогревают при 65 - 70 °C 30 минут, затем фильтруют и с ней проводят все манипуляции, описанные ниже.

 

Сигнальные методы исследования

 

В качестве сигнальных (экстренных) методов бактериологического исследования направленного материала используются люминесцентно-серологический метод, метод выявления капсулообразования in vitro и метод выявления капсулообразования in vivo.

Эти методы позволяют судить о наличии в исследуемом материале B. anthracis лишь ориентировочно (сигнально) и требуют обязательного дальнейшего исследования с выделением чистой культуры и изучением ее свойств, т.е. проведения окончательной дифференциации палочки сибирской язвы.

 

Метод выявления капсулообразования in vitro

 

Для изучения капсулообразования in vitro делают посевы нескольких капель исходной испытуемой взвеси в среду Государственного контрольного института медицинских биологических препаратов им. Тарасевича (ГКИ) и ставят в термостат при 37 °C.

Через 30 - 120 минут начинается капсулообразование in vitro. Следует считать, что через 16 - 18 часов все или абсолютное большинство B. anthracis, если таковые находятся в исследуемом материале, образуют на среде ГКИ капсулу.

Для наблюдения за капсулообразованием мазки из культур со среды ГКИ после подсыхания и фиксации в течение 15 минут метанолом окрашивают 5 - 10 минут синькой Леффлера и просматривают в микроскопе (х900). Микробы окрашиваются в синий цвет, а капсула - в розовый.

В случае обнаружения капсульных клеток в препаратах со среды ГКИ дается положительный сигнальный ответ, а полученная культура подлежит дальнейшему исследованию для выделения из нее чистой культуры и изучения ее свойств.

 

Метод выявления капсулообразования in vivo

(ускоренная биологическая проба)

 

Исходный материал вводят по 0,5 мл внутрибрюшинно 6 белым мышам.

После введения исследуемого материала животным одну пару мышей оставляют под наблюдением на 10 суток как при классической биологической пробе. Остальных мышей забивают (по 2 на срок) через 1 и 2 часа. Забитых мышей вскрывают. Из перитонеального экссудата и крови сердца делают мазки, из селезенки, почек, легких, печени делают мазки-отпечатки, нефиксированные мазки окрашивают по Ребигеру, а фиксированные - лефферовской синькой и микроскопируют на предмет выявления капсульных палочек сибирской язвы.

Обнаружение в мазках типичных капсульных палочек позволяет лаборатории дать положительный сигнальный ответ и продолжить анализ для выделения из органов животных культур и дальнейшего их изучения (см. раздел "Идентификация палочки сибирской язвы в лаборатории"). Если в мазках из экссудата органов забитых мышей не обнаруживаются капсульные палочки, то продолжают наблюдение за контрольной парой. При отсутствии необходимого для данного метода количества мышей заражают только по одной белой мыши на срок.

 

Люминесцентно-серологический метод

 

Люминесцентно-серологический метод может быть использован как для обнаружения спор сибиреязвенного микроба непосредственно в исследуемом материале, так и вегетативных бескапсульных клеток:

а) для выявления спор B. anthracis из исследуемого материала делают мазок на предметном стекле, ближе к краю стекла. Мазок подсушивают и фиксируют в течение 10 - 15 минут погружением в метанол, налитый в стеклянные стаканчики высотой 5 - 6 см. После высыхания препараты окрашивают люминесцирующей споровой сибиреязвенной сывороткой;

б) для выявления вегетативных бескапсульных клеток B. anthracis в исходном материале или после подращивания делают препараты способом, описанным в пункте "а".

Препараты окрашивают люминесцирующей адсорбированной сибиреязвенной сывороткой.

Сухую люминесцирующую сыворотку растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды. Разведенную сыворотку хранят в пробирке с резиновой пробкой или в запаянной ампуле при 4 °C.

Перед использованием каждой серии конъюгата рекомендуется опытным путем проверить рабочее разведение люминесцирующей сыворотки, указанное на этикетке ампулы. С этой целью микроскопируют мазки из вакционных сибиреязвенных штаммов, окрашенные в течение 10 - 15 минут конъюгатом, взятым в разных разведениях (обязательно на 1 - 2 разведения выше и ниже рабочего разведения, указанного на этикетке).

То максимальное разведение, которое обеспечивает яркое (на ++++ и +++) иммунофлуоресцентное окрашивание микробных клеток, называют красящим титром. В качестве рабочего разведения принимают удвоенный красящий титр. Необходимость опытного определения рабочего разведения обусловлена тем, что оно зависит не только от качества люминесцирующего конъюгата, но и от освещения препарата в люминесцентном микроскопе. Поэтому при работе с различными аппаратами для люминесцентной микроскопии (МЛ-1, МЛ-2, МЛД-1 и т.д.) рабочее разведение люминесцирующей сыворотки может отличаться от указанного в паспорте.

    Непосредственно  перед  окраской  препарата  люминесцирующую  сыворотку

разводят  забуферным  0,15 М  раствором NaCl  (pH = 7,2 - 7,4)  до рабочего

разведения  в  необходимом  для  работы  объеме.  Разведенную  до  рабочего

разведения сыворотку хранить не следует. Забуферный 0,15 М NaCl (pH = 7,2 -

7,4)  готовят  следующим  образом:  к 1000 мл  0,15 М NaCl  добавляют 10 мл

фосфатного  буфера,   составленного   из  90 мл  0,15 М   раствора  Na HPO

                                                                      2   4

(1 г 620 мг  на  100 мл  дистиллированной воды)  и из 10 мл 0,15 М раствора

KH PO  (2 г 230 мг на 100 мл дистиллированной воды) и проверяют pH.

  2  4

Фиксированные препараты помещают во влажную камеру (чашки Петри), кюветы, эксикаторы с каплями 0,15 М NaCl или увлажненной фильтровальной бумагой и наносят на них пастеровской пипеткой каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. Окраску производят в течение времени, указанного в этикетке, при комнатной температуре. Затем мазки два раза тщательно промывают раствором 0,15 М NaCl по 10 минут в стеклянных стаканчиках или под текущей струей из пластмассового баллона и подсушивают на воздухе.

Перед просмотром на препараты наносят каплю раствора, содержащего 1 часть 0,15 М NaCl (pH = 7,2 - 7,4) и 9 частей глицерина и накрывают покровным стеклом. Препараты можно просматривать и без покровных стекол. Мазки микроскопируют в падающем свете люминесцентного микроскопа с системой светофильтров под иммерсионным объективом. При работе с иммерсионным объективом необходимо пользоваться нефлуоресцирующим иммерсионным маслом.

Для получения наиболее яркого свечения бактерий следует тщательно центрировать осветительную систему микроскопов и подбирать соответствующие светофильтры.

Целесообразно сочетать просмотр препаратов одного и того же поля зрения одновременно в люминесцентном микроскопе (освещение сверху) и в фазово-контрастном устройстве (освещение снизу) для определения наличия в препарате клеток бактерий, не окрашенных примененной люминесцирующей сывороткой.

Наблюдение проводят при увеличениях 5 x 90, 7 x 90, 10 x 90. Споры и бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, дают яркое свечение периферии клетки, имеющей характерную для исследуемого вида морфологию. Такое свечение называется специфическим в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным свечением всего тела клетки (следует иметь в виду, что в препаратах из органов животных и культуры тканей обычная морфология клеток микроорганизмов может быть изменена).

Для оценки интенсивности свечения используется четырехкрестовая система:

++++ - очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастируемая с темным телом клетки;

+++ - яркая флуоресценция периферии клетки;

++ или + - слабое свечение периферии клетки, не контрастируемое с телом клетки.

Положительным результатом считается люминесценция клеток, оцениваемая на ++++ и +++ при наличии 2 - 5 специфически светящихся клеток в каждом поле зрения.

в) Если в препаратах, при обработке их люминесцирующими сибиреязвенными сыворотками, обнаружатся ярко светящиеся по периферии микробные клетки (на ++++ и +++), что характерно для спор или вегетативных клеток anthracis, это говорит о подозрениях на наличие в исследуемой пробе B. anthracis и может рассматриваться как ориентировочный сигнальный ответ. Такая проба подлежит дальнейшему исследованию.

 

Идентификация палочки сибирской язвы в лаборатории

 

Подозрительные колонии, выделенные на питательных средах, дифференцируют как сибиреязвенные по следующим опорным признакам: специфическая патогенность, капсулообразование, тест жемчужного ожерелья; лизабильность бактериофагом; люминесцентно-серологический метод; и по дополнительным признакам: лецитиназная активность; неподвижность; отсутствие гемолиза.

Специфическая патогенность - определяется проведением биологической пробы на белых мышах и степенью вирулентности выделенных культур.

Биологическая проба на белых мышах: 2 - 3 белым мышам весом не более 18 - 20 г вводят внутрибрюшинно или подкожно исследуемую пробу в объеме 0,2 мл. Наблюдение за животными ведут до их гибели. Из селезенки и печени погибших животных делают посевы и тонкие мазки, которые после фиксации окрашивают синькой Леффлера или люминесцирующими капсульными сыворотками. Нахождение в мазках капсульных клеток позволяет сделать заключение о специфической патогенности возбудителя, обнаруженного в исследуемой пробе.

Определение вирулентности выделенных культур. Для этой цели необходимо приготовить споровую культуру на среде из казеинового перевара. Культуру, подлежащую исследованию, засевают на эту среду и на четвертые сутки инкубирования в термостате при 37 °C получают в посеве до 95 - 100% спор. Процесс спорообразования контролируют просмотром мазков, неокрашенных - в фазовом контрасте или окрашенных по Циль-Нильсену. Затем споровая культура смывается с агара и заключается в 50%-ный глицерин или лиофилизируется.

Вирулентность определяется так: берут кроликов весом 2 - 2,5 кг, вводят им подкожно в область живота в объеме 1 мл три дозы споровой культуры - 100, 1000 и 10000 спор. Предварительно споровая культура разводится 0,15 М NaCl до стандарта мутности ГКИ N 10, который соответствует примерно 100 мл сибиреязвенных спор. Из последующих разведений получают необходимые дозы. Каждая доза вводится 2 кроликам. Всего для определения вирулентности одной культуры требуется 6 кроликов.

Наблюдение за животными длится до 10 суток. Из органов павших животных делают мазки для бактериоскопии и посевы на соответствующие среды для установления специфичности гибели животных.

В ответе лаборатории указывают, что испытуемая культура вирулентна для кроликов в испытанной дозе (или - апатогенна для кроликов).

Капсулообразование устанавливается либо в результате изучения мазков из посевов на среду Государственного контрольного института медицинских биологических препаратов им. Тарасевича или на сывороточный бульон (инкубация при 37 °C и течение 16 - 18 часов), либо в результате исследования мазков из крови и мазков-отпечатков из органов биопробных животных, окрашенных одним из вышеописанных методов для выявления капсул.

Неподвижность B. anthracis определяется при исследовании в висячей капле.

Отсутствие гемолиза определяется при посевах на МПА с добавлением 5 - 10% дефибринированной крови барана, посевы инкубируются при 35 - 37 °C в течение 18 - 20 часов, после чего производится учет.

Лецитиназная активность определяется по интенсивности свертывания куриного желтка на жидкой яичной среде Дрожевкиной. Среду готовят путем смешивания в стерильной бутылочке со стеклянными бусами одной части куриного желтка, извлеченного асептически, и двух частей стерильного 0,85% раствора хлористого натрия. Среду разливают по 5 мл в пробирки, засевают петлей испытуемой суточной культуры, инкубируют при 37 °C. B. anthracis, как правило, желток не свертывает даже в течение нескольких суток инкубирования, в то время как, например, B. cereus свертывает среду в течение 6 - 10 часов.

Тест жемчужного ожерелья. Перед постановкой пробы 2% МПА разливают по 10 мл в пробирки. Готовят 3 чашки 2% МПА, наливая в каждую из них агар из одной пробирки; предварительно к агару первой пробирки после его расплавления и охлаждения, добавляют пенициллин из расчета 0,5 ед./мл, к агару второй - 0,05 ед./мл, третья - контрольная. На каждой чашке после застывания агара обратной стороной пробирки делают насечки агара, которые на обратной стороне чашки обозначают номером анализа.

На каждый полученный таким образом кружок агара наносят 1 каплю 3-часовой бульонной культуры исследуемого штамма. На одной чашке может быть поставлено 10 - 15 проб. Чашки с закрытыми крышками инкубируют при 37 °C, через 3 часа просматривают под микроскопом с сильной сухой или иммерсионной системой (в последнем случае каждый кружок агара накрывают покровным стеклом). Рекомендуется использовать фазовоконтрастное устройство.

На среде, содержащей пенициллин, наблюдается распад клеток B. anthracis на отдельные шары-жемчужины, расположенные в виде цепочек. Другие спороносные аэробы имеют обычную форму клеток. В контрольной чашке B. anthracis образует длинные цепи клеток.

Модификация теста жемчужного ожерелья. К бульону на переваре Хоттингера (pH = 7,2 - 7,4) добавляют стерильно 20% инактивированной лошадиной сыворотки и 0,5 ед. пенициллина на 1 мл бульона. Среду разливают с соблюдением стерильности в пробирки по 2 - 3 мл и засевают 2 капли бульонной или петлю агаровой культуры испытуемого микроба. Пробирки с посевами инкубируют в течение 3 часов при 37 °C, после чего делают мазки на стекле, фиксируют жидкостью Карнау (6 частей этилового спирта, 3 части хлороформа и 1 часть ледяной уксусной кислоты) до ее испарения, окрашивают метиленовой синькой 20 - 30 секунд и микроскопируют.

В мазках B. anthracis обнаруживается в виде цепочек шарообразных форм, напоминающих ожерелье из жемчуга или бус.

B. cereus и другие сапрофитные бациллы на среде с пенициллином растут как обычно, и в мазках наблюдаются цепочки палочек. В случае отрицательных результатов инкубацию посевов следует продолжить до 6 часов, и тогда делается заключительный учет теста.

Люминесцентно-серологический метод. Люминесцентно-серологический метод может быть использован как для серологической идентификации чистых культур, так и для обнаружения капсульных форм возбудителя в препаратах из органов экспериментально зараженных животных.

Для идентификации чистых культур используют люминесцирующие сибиреязвенные адсорбированные сыворотки. Обработка препаратов производится по методике, изложенной в разделе "Сигнальные методы исследования".

Чтобы выявить капсульные формы возбудителя сибирской язвы, готовят мазки из экссудата брюшной полости через 5 - 6 часов после внутрибрюшинного введения спорового материала; из отечной жидкости - через 10 - 18 часов после подкожного введения и из отпечатков селезенки, печени животных. Мазки фиксируют погружением их в метанол на 15 - 20 минут. Затем мазки обрабатывают капсульной сибиреязвенной сывороткой в рабочем разведении в течение 20 минут во влажной камере (чашки Петри или кюветы с увлажненной бумагой или каплями 0,15 М NaCl). Препараты промывают забуференным раствором 0,15 М NaCl - pH = 7,2 - 7,4 - в течение 10 минут и докрашивают люминесцирующей сывороткой против глобулинов кролика в рабочем разведении, смешанной с бычьим альбумином, меченным родамином в течение 15 минут. Мазки промывают вышеуказанным способом, подсушивают, наносят каплю забуференного глицерина (1 часть забуференного 0,15 М NaCl - pH = 7,2 - 7,4 и 9 частей глицерина) и закрывают покровным стеклом.

Можно просматривать препараты и без покровных стекол. Препарат готов для просмотра в люминесцентном микроскопе. В препаратах, содержащих капсульные клетки, наблюдается ярко-зеленое свечение капсулы. Учитывая, что капсула сибиреязвенного микроба в организме может разрушаться, необходимо параллельные препараты обрабатывать люминесцирующими адсорбированными сибиреязвенными сыворотками.

Обнаружение капсульных форм в организме мышей позволяет дать положительный ответ о наличии возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале. Для определения степени вирулентности культуры необходима постановка специальной пробы.

Лизабильность бактериофагом. В чашки Петри с ровным дном разливают расплавленный и остуженный до 45 °C 1,5% МПА. Когда агар застынет, дно чашки расчерчивают на квадраты со стороной, равной 2 см. После просушивания чашки в термостате петлей с диаметром 5 мм или пастеровской пипеткой на каждый квадрат наносят каплю 5 - 6-часовой культуры. Чашку с приоткрытой крышкой подсушивают в течение 10 мин. в термостате, а затем в центр подсохшей капли культуры наносят петлей диаметром в 2 мм каплю бактериофага. Результаты учитываются через 5 - 6 часов инкубации при 37 °C. В случае положительного результата на месте нанесения капли бактериофага отмечается лизис колонии, независимо от степени вирулентности идентифицируемого штамма B. anthracis.

 

Заключение по бактериологическим исследованиям

 

Предварительное заключение лаборатория может дать после проведения сигнальных исследований через 3 - 5 часов после поступления материала.

Окончательное заключение лаборатории о принадлежности выделенного микроорганизма к палочке сибирской язвы может быть дано на основании совокупности по крайней мере 2 - 3 опорных признаков, в числе которых признак специфической патогенности обязателен.

 

4. ОБНАРУЖЕНИЕ ЛЕПТОСПИР

 

В водоисточниках обитают лептоспиры - сапрофиты, морфологически и по характеру движения не отличающиеся от патогенных форм этого рода микроорганизмов. Однако помимо сапрофитов в различные водоисточники (речки, болота, пруды, ирригационные каналы и т.д.) и во влажные места (луга, рисовые поля, угольные копи и т.д.) проникают и патогенные для человека и животных лептоспиры, которые могут в течение нескольких недель оставаться жизнеспособными (К.Н. Токаревич, 1969).

Большое эпидемиологическое значение имеет выделение из водоисточников лептоспир определенного типа, являющегося возбудителем соответствующей вспышки.

Поэтому необходимо производить всестороннее изучение полученных водных штаммов: антигенная структура, биохимические свойства и инфекционность для лабораторных животных. Идентификация выделенной культуры значительно упрощается, когда она проявляет тождественность по своим серологическим свойствам с одним из 13 диагностических штаммов <*>, каждый из которых характеризует определенную серогруппу лептоспир, являющихся возбудителями лептоспирозов у людей и животных. Между тем низкий уровень продукции ферментов оксидазы и лецитиназы лептоспирами также может служить определением их как паразитов.

--------------------------------

<*> См. Методические указания по серологической диагностике лептоспирозов Министерства здравоохранения РСФСР, 1967.

 

Для исследования воды на наличие лептоспир по В.И. Терских (1945) забираются следующие пробы (в стерильную посуду):

1) вода и слизистые пробки из водопроводного крана;

2) вода из поверхностного слоя водоема;

3) придонные кусочки слизи вместе с водой;

4) придонный песок или ил вместе с водой.

Причем три последние пробы обязательны при обследовании открытых водоемов.

Для обнаружения лептоспир в воде могут быть использованы следующие методы.

Метод прямого микроскопического исследования. Из поверхностного слоя и кусочков слизи готовят не менее 10 препаратов "раздавленная капля" (нативный материал наносят на предметное стекло и покрывают покровным стеклом).

Одновременно с этим концентрируют центрифугированием 50 мл при 10000 об./мин. в течение часа или ультрафильтрацией через мембранные нитроцеллюлозные фильтры N 1 (производство Мытищинской экспериментальной фабрики) 500 мл предварительно освобожденной от песка и ила испытуемой воды. Из полученного осадка в центрифужном стакане и смыва физиологическим раствором с фильтра готовят препараты "раздавленная капля", которые и микроскопируют с конденсором темного поля ОИ-13 при увеличении х400. При этом используется иммерсионная система (дистиллированная вода) между поверхностями конденсора и препарата.

Наличие лептоспир устанавливают по их типичной морфологии и подвижности. Этим методом лептоспиры обнаруживаются редко, но положительные результаты указывают на благоприятные условия для размножения лептоспир в обследуемом водоисточнике.

Бактериологический метод исследования (модификация В.И. Терских). Вначале определяется pH исследуемой воды. Если pH сильно отклоняется от нейтральной реакции, то при помощи фосфатных молярных растворов реакцию воды доводят до pH 7,2. Если этого не требуется, сразу к 300 мл исследуемой воды, взятой из водоема, прибавляют 10 - 20% фосфатной буферной смеси с pH 7,2. После основательного перемешивания добавляют 1 мл свежего куриного желтка и 1 мл растопленного горячего, приготовленного на дистиллированной воде, 2% просветленного агара, предварительно промытого водой.

Смесь слегка перемешивают и разливают по чашкам Петри (примерно по 25 мл). Чашки инкубируют при 28 - 30 °C. Спустя двое суток от начала культивирования чашки с посевами заделывают лейкопластырем с тем, чтобы не было высыхания. Микроскопическое исследование производят каждые пять дней. Причем для этой цели берут материал из различных мест чашек.

Фильтрат испытуемой пробы воды после фильтрации через мембранный фильтр N 1 засевают или на жидкую питательную среду с сывороткой, или на сывороточный агар.

Как только выявляется не менее 30 лептоспир в поле зрения микроскопа следует провести предварительную реакцию агглютинации с различными типовыми специфическими сыворотками.

Получение чистой культуры. Смешанную культуру засевают на сывороточный агар, который готовят следующим образом. Берут 1,0 просветленного агара или агара "Дифко" и 100 мл фосфатной смеси pH 7,2. Кипятят и автоклавируют. Перед употреблением к этому агару, растопленному и охлажденному до 60 °C, прибавляют 10% инактивированной нормальной сыворотки кролика; полученный сывороточный агар и служит для дробного посева на чашках Петри. Причем посев производится при охлаждении агара до 40 °C. Исследуемую смешанную культуру можно предварительно подвергнуть центрифугированию при 2000 - 3000 об./мин. с тем, чтобы осели посторонние микроорганизмы; для посева берут поверхностный слой жидкости, содержащий нередко лептоспиры; чашки Петри с посеянной культурой лептоспир выдерживают в термостате при 30 °C в течение 10 - 12 дней, после чего вырезают пипеткой участки сывороточного агара, свободные от видимого поверхностного прироста, которые нередко содержат лептоспир, и переносят их в пробирки с жидкой питательной средой. Наиболее вероятно обнаружение лептоспир в колониях, растущих внутри агара, без поверхностного роста, и имеющих голубовато-мутноватый цвет.

Метод заражения животных для выделения лептоспир из воды. Для этой цели можно использовать золотистых хомяков, молодых морских свинок, крольчат-сосунков. Исследуемую пробу центрифугированной воды вводят в количестве 10 мл подкожно. Можно орошать скарифицированную поверхность кожи испытуемой водой, для чего шерсть на брюшке выщипывают или сбривают так, чтобы образовались повреждения кожи, после чего эти участки кожи погружают в воду не менее чем на 2 часа. Наблюдения ведут за животными в течение месяца, ежедневно термометрируя. При подъеме температуры стерильно берется кровь из сердца и засевается на жидкую питательную среду. При гибели животных или их забое дополнительно сеют кровь, печень и почки. Кровь погибших и забитых животных после указанного срока наблюдения исследуется в реакции агглютинации и лизиса диагностическим набором штаммов лептоспир на наличие лептоспирозных антител.

Можно испытуемую воду центрифугировать в течение 20 мин. при 10000 об./мин. и 6-ти часов при 3000 об./мин. Осадком заражают животных.

Заболевание у животных может развиваться на 5 - 11 дни от момента заражения.

 

5. ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ

 

Исследованию подвергают воду, взятую из прибрежных частей водоемов - ручьев, канав, прудов, озер и т.д., заселенных грызунами, особенно водяной крысой или ондатрой, а также колодцев (при попадании в них грызунов). Забор воды производят в стерильные сосуды емкостью 200 - 250 мл или в обычные пробирки. Процедура забора воды обычная с соблюдением стерильности.

Исследование воды производят в день доставки в лабораторию или в крайнем случае на следующий день, при условии сохранения ее в рефрижераторе.

Воду исследуют только биологическим методом, т.е. путем введения ее чувствительным к туляремии лабораторным животным - белым мышам или морским свинкам. Этим путем можно обнаружить в воде единичные туляремийные бактерии.

Белой мыши вводят подкожно 0,5 - 1 мл, а морской свинке - 5 - 10 мл воды. Если исследуют ограниченное число проб воды, то желательно от каждой взятой пробы воды поставить на животных 2 - 4 биопробы. При большом числе проб воды, особенно взятых одновременно из смежных участков какого-либо одного водоема, можно ограничиться постановкой от каждой из них по одной биопробе.

Подопытных животных содержат в помещении с соблюдением режима работы с особо опасными инфекциями.

Биопробных животных содержат поодиночке в стеклянных банках. В положительных случаях животные через некоторое время после введения воды погибают от туляремии, в отрицательных - остаются здоровыми. Белые мыши обычно погибают на 5 - 6 сутки, но иногда через 8 - 10 и даже 15 - 18 суток (последнее - крайне редко).

Морские свинки погибают от туляремии на 6 - 25 сутки, обычно на 8 - 10 сутки.

Павших животных вскрывают и делают из селезенки и крови мазки и посевы на свернутую желточную среду Мак Коя. Мазки фиксируют в смеси Никифорова (этиловый спирт и серный эфир пополам), окрашивают по Романовскому-Гимза, высушивают и просматривают в обычный микроскоп с иммерсионным объективом. Посевы инкубируют в термостате при 37 °C 1 - 3 суток и выросшую культуру подвергают дальнейшему изучению.

Выживших биопробных животных забивают: белых мышей на 18-й день, морских свинок - на 25-й день. Из селезенки делают контрольный посев на свернутую желточную среду, последний инкубируют при 37 °C 10 дней.

 

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК

 

При исследовании сточной воды и воды открытых водоемов (индекс кишечной палочки > 300000) производят прямой посев на чашки со средой Эндо или Левина и со средой Плоскирева. Выбор разведений воды и ее количества для посева делают с таким расчетом, чтобы на чашке со средой Эндо (или Левина) выросло от 50 до 300 колоний. На среду Плоскирева высевают в 10 - 20 раз больше бактерий. Питьевую воду и воду открытых водоемов с низким индексом кишечной палочки предварительно фильтруют в количестве 500 мл через мембранный фильтр, который затем помещают в 50 мл среды накопления, используемой при определении бактерий группы кишечной палочки (см. ГОСТ "Вода питьевая"). Через сутки инкубации при 37 °C производят посев на среду Эндо или Левина и среду Плоскирева. Выращивание бактерий на плотных средах проводят также при 37 °C в течение суток.

При наличии на чашках со средой Эндо (или Левина) роста однотипных колоний намечают для изучения 10 колоний. Если же обнаруживается рост двух, трех и более типов колоний, намечают по 5 колоний каждого типа. На чашках со средой Плоскирева намечают только слаборозовые и бесцветные колонии, напоминающие шигелл.

Идентификация энтеропатогенных эшерихий основывается на следующих принципах:

1. Первичный отбор колоний (или полученных из них после пересева культур) при помощи реакции агглютинации на стекле с OK-сыворотками против энтеропатогенных разновидностей эшерихий.

2. Индикация соматических O- и K-антигенов в линейной пробирочной реакции агглютинации с использованием OK-сыворотки и соответствующей O-сыворотки.

3. Подтверждение принадлежности выделенного штамма к эшерихиям при помощи ферментативных тестов.

4. Идентификация у выделенных штаммов энтеропатогенных разновидностей эшерихий H-антигена.

Намеченные колонии исследуют в реакции агглютинации на стекле с поливалентными OK-коли-сыворотками (при наличии в лаборатории не более двух таких сывороток). Для дальнейшего изучения отсевают на скошенный в пробирках простой питательный агар только те колонии, которые дали положительную реакцию агглютинации. Если такого испытания не проводилось, отсевают все намеченные колонии.

На следующий день выросшие на скошенном агаре культуры испытывают в реакции агглютинации на стекле с той поливалентной сывороткой, с которой накануне был получен положительный результат. Культуры, полученные из колоний, не испытывающихся в реакции агглютинации, проверяют на стекле со всеми имеющимися в лаборатории поливалентными OK-коли-сыворотками. Культуры, агглютинировавшиеся какой-либо из поливалентных сывороток, испытывают в реакции агглютинации на стекле с моновалентными OK-сыворотками, соответствующими той поливалентной, с которой был получен положительный результат.

Для дальнейшего исследования берут только те культуры, которые агглютинировались какой-либо из моновалентных (типовых) сывороток. Готовят и микроскопируют окрашенные по Граму мазки. Чистые культуры бактерий, состоящие из грамотрицательных палочек, отсевают на дифференциальные среды для определения ферментативных свойств и подвижности (табл. 1).

 

Таблица 1

 

ОГРАНИЧЕННЫЙ НАБОР ТЕСТОВ, ПОЗВОЛЯЮЩИЙ УСТАНОВИТЬ

ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ ВЫДЕЛЕННОГО ШТАММА К РОДУ E. COLI

 

┌───────────────────────────────────────────┬─────────────────────────────┐

│                   Тесты                   │   Биохимические варианты    │

│                                           │          эшерихий           │

│                                           ├────┬────┬────┬────┬────┬────┤

│                                           │ 1  │ 2  │ 3  │ 4  │ 5  │ 6  │

├───────────────────────────────────────────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┤

│Образование сероводорода (на трехсахарном  │-   │-   │-   │-   │-   │-   │

│агаре с солью Мора или агаре Клиглера)     │    │    │    │    │    │    │

│Газообразование из глюкозы (на трехсахарном│+   │-   │+   │-   │+   │-   │

│агаре с солью Мора или агаре Клиглера)     │    │    │    │    │    │    │

│Ферментация 10% лактозы                    │+   │+   │+   │+   │-   │-   │

│Индолообразовение                          │+   │+   │-   │-   │+   │+   │

│Расщепление мочевины                       │-   │-   │-   │-   │-   │-   │

│Утилизация цитратов (на среде Симмонса)    │-   │-   │-   │-   │-   │-   │

│Подвижность                                │+   │+   │+   │+   │+   │+   │

│                                           │или │или │или │или │или │или │

│                                           │-   │-   │-   │-   │-   │-   │

└───────────────────────────────────────────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┘

 

Примечание. Неподвижные штаммы 5 и 6 биохимических вариантов требуют дополнительной дифференциации с шигеллами.

 

Оставшуюся часть культуры (в живом и прогретом виде) исследуют при помощи линейной реакции агглютинации в пробирках по общепринятой методике с типовой OK-сывороткой, с которой был получен положительный результат на стекле. При наличии в лаборатории O-коли-сывороток пробирочную реакцию агглютинации прогретой культуры проводят только с соответствующей O-сывороткой.

При использовании для реакции агглютинации только OK-сыворотки оценку полученных результатов делают в соответствии с общепринятыми принципами. Результаты, полученные при параллельном использовании OK- и O-сывороток, оценивают следующим образом:

1. Крупнохлопчатый агглютинат, наблюдающийся в OK-сыворотке до 1/2 титра или до титра K-антител, и мелкозернистый агглютинат в O-сыворотке до 1/2 титра или до титра O-антител расценивают как положительный результат, свидетельствующий о принадлежности выделенного штамма к соответствующей OK-группе.

2. Крупнохлопчатый агглютинат до 1/2 титра или до титра K-антител в OK-сыворотке и отсутствие агглютинации в O-сыворотке или наличие агглютината в этой сыворотке лишь в разведениях ниже 1/2 титра O-антител свидетельствует о наличии антигенной связи выделенного штамма с эшерихиями соответствующей OK-группы, но не о принадлежности к ней.

3. Мелкозернистый агглютинат живой культуры, наблюдающийся в разведениях OK-сыворотки, превышающих титр K-антител, и мелкозернистый агглютинат прогретой культуры в O-сыворотке в высоких разведениях или до ее титра свидетельствует об общности или идентичности O-антигена выделенного штамма с O-антигеном эшерихий соответствующей серогруппы и отсутствии или слабом развитии K-антигена. Такой штамм необходимо направить во Всесоюзный центр по эшерихиям.

При исследованиях, особенно проводимых по эпидпоказаниям, важное значение имеет определение H-антигена у подвижных штаммов. В настоящее время в СССР осуществляется производственное изготовление H-коли-сывороток (15 наименований), предназначенных для серологической идентификации H-антигена у эшерихий энтеропатогенных разновидностей методом иммобилизации в полужидком агаре.

Окончательное заключение делают на основании результатов как серологических, так и биохимических исследований выделенных культур бактерий.

 

III. САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ

 

Выбор того или иного метода обнаружения энтеровирусов в воде определяется в первую очередь степенью загрязнении воды, которая должна быть подвергнута санитарно-вирусологическому анализу.

Выделение энтеровирусов из сточных вод производится довольно легко в связи со значительной концентрацией в них энтеровирусов. Санитарно-вирусологические исследования воды открытых водоемов сопряжены с большими трудностями, т.к. в этом случае имеет место сравнительно низкая концентрация энтеровирусов в воде.

Следовательно, необходимым этапом исследования воды открытых водоемов (а еще в большей степени водопроводной воды, прошедшей соответствующую очистку и обеззараживание) или воды плавательных бассейнов является предварительное концентрирование вирусов в пробе перед собственно вирусологическим исследованием.

Исходя из этого принципа в настоящей инструкции рекомендуются следующие методы концентрации вирусов в воде.

Для индикации вирусов в сточных водах наиболее целесообразно использование метода концентрирования на марлевом тампоне (тампонный метод Моора).

При санитарно-вирусологических исследованиях воды открытых водоемов могут быть рекомендованы: метод концентрирования на марлевом тампоне, помещаемом в ток воды на несколько суток или, при одноразовом отборе проб воды, - метод вращающегося тампона, использование колонок с ионообменными смолами и метод фильтрации через растворимые лантан-алюминий-альгинатные ультрафильтры.

Для выделения энтеровирусов из питьевой воды и воды плавательных бассейнов перспективным является использование тампонного метода, метода сорбции на ионообменных смолах в модификациях, которые дают возможность концентрировать вирусы из возможно большего объема воды, а также метод фильтрации через растворимые ультрафильтры.

 

Выбор места отбора проб воды

 

Отбор проб сточных вод для санитарно-вирусологических исследований производится либо на очистных сооружениях, либо из коллекторов отдельно стоящих зданий. В каждом конкретном случае выбор места отбора проб зависит от целей исследования.

Так, например, при оценке эффективности очистки сточных вод от энтеровирусов целесообразно производить отбор проб из входного коллектора, после основных этапов очистки - и очищенную сточную воду.

При исследованиях, преследующих своей целью изучение вопросов циркуляции энтеровирусов среди населения путем обследования сточных вод, необходимым является изучение спектра энтеровирусов в сточных водах, поступающих на очистные сооружения. Исследованию подлежат только сточные воды с преобладанием бытовых стоков. Выбор места отбора проб сточных вод необходимо проводить при консультации со специалистами коммунального отдела СЭС.

Санитарно-вирусологический анализ воды открытых водоемов следует производить при гигиенической оценке прибрежной полосы воды в районе пляжей и мест массового отдыха населения; изучении степени загрязнения воды открытых водоемов в отношении вирусов; выборе водоисточника для целей водоснабжения и др.

 

1. МЕТОДЫ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

 

а) Тампонный метод

 

Отбор проб

 

Для приготовления тампона вырезают три 16-слойных марлевых квадрата размером 10 x 10 см, марлевые квадраты складывают накрест для увеличения поверхности тампона и прошивают капроновой леской. Свободный конец лески составляет 1 - 2 метра. Тампоны заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве.

Стерильные тампоны на капроновой леске погружают на 5 - 7 суток в ток воды в точках отбора проб.

Сбор тампонов и транспортировку их в лабораторию производят в стерильных условиях в стеклянных стаканах емкостью 0,5 - 1,0 л или в полиэтиленовых мешочках размером 25 x 35 см. Последние стерилизуют кипячением. Пробы транспортируют в лабораторию в специальных ящиках с гнездами. Отбор проб производят в резиновых перчатках. Тампоны до обработки хранят в холодильнике в замороженном состоянии при -15 - -20 °C.

 

Обработка проб

 

Пробы (тампоны) предварительно размораживают. В полиэтиленовый мешочек или в стеклянный стакан, где находится тампон, добавляют от 10 до 20 мл 0,5 М фосфатного буфера (в зависимости от степени влажности тампона). Тампон тщательно разминают в течение 5 мин. и отжимают. Выход каждой пробы составляет примерно 60 - 100 мл. Проверяют pH жидкости; для получения pH 8,0 - 8,2 к пробе в случае необходимости добавляют несколько капель 1 N NaOH и снова тщательно перемешивают. Щелочная реакция среды создает лучшие условия для десорбции энтеровирусов с тампона в жидкую фазу пробы.

После установления необходимой реакции среды жидкую фазу пробы переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2,5 тыс./об. в мин. в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильные центрифужные стаканы, закрывают резиновыми пробками и замораживают при -15 - -20 °C на 1 - 2 суток.

По истечении этого срока пробу оттаивают и снова центрифугируют при том же режиме. После центрифугирования надосадочную жидкость переносят в стерильные пенициллиновые флаконы и добавляют равное по объему количество этилового эфира. Эфир и пробу тщательно смешивают пипетированием или встряхиванием на шуттель-аппарате до получения гомогенной эмульсии. Флаконы закрывают ватными пробками и помещают в холодильник при температуре 4 - 6 °C. После того как эфир испарится (3 - 4 дня), флаконы перекрывают резиновыми пробками и хранят в замороженном состоянии при -15 - -20 °C до последующего вирусологического анализа.

 

б) Метод вращающегося тампона

 

Отбор проб

 

Производят одноразовый отбор проб исследуемой воды в объеме 3 - 5 л в стерильную бутыль. Первичную обработку проб воды желательно производить в день отбора. Если это невозможно, то пробу до следующего дня помещают в холодильник при температуре 4 - 6 °C. Хранить необработанные пробы воды более 24 часов не рекомендуется, т.к. при этом снижается титр энтеровирусов.

 

Обработка проб

 

Пробу воды переливают в стерильную широкогорлую банку. Стерильный марлевый тампон, подготовленный вышеописанным способом, привязывают к стеклянному шпателю. Последний соединяют с электрическим моторчиком. На тампон в нескольких местах наносят нативную бычью сыворотку в объеме 1 - 3 мл и погружают его в пробу на уровне средней трети глубины воды. Моторчик включают в электросеть и регулируют таким образом, чтобы скорость вращения тампона составляла 25 - 30 оборотов в минуту. При этом достигается равномерное перемешивание всей массы воды в банке; длительность контакта тампона с пробой должна составлять 30 - 40 минут. Затем тампон переносят в стерильный химический стакан. Дальнейшая обработка пробы проводится как описано в предыдущей методике.

 

в) На ионообменной колонке

 

Для концентрирования вирусов используют сильноосновной анионит отечественного производства АВ-17. Указанный анионит производится в гидроксильной и хлор-формах, обе формы могут быть использованы для адсорбции вирусов.

Перед употреблением сухую ионообменную смолу для набухания замачивают в бидистиллированной воде не менее чем на 24 часа. После этого смолу переводят в хлор-форму путем обработки ее в течение 3 - 4 дней HCl 1 N для гидроксильной и 0,5 N для хлор-формы из расчета не менее 0,5 литра кислоты на 100 мл набухшей смолы. Затем смолу промывают стерильной бидистиллированной водой до тех пор, пока pH воды не станет нейтральным или равным pH исходной воды. Обработанную смолу вместе с бидистиллированной водой заливают в бюретку на 25 - 30 мл, на дно которой помещают кусочек стеклянной ваты. Высота столбика смолы 8 - 10 см. До использования смолу необходимо держать под водой.

На ионообменной колонке можно концентрировать вирусы из разовых (3 - 5 л) проб воды, а также непосредственно из водопровода.

При исследовании разовой пробы воды в бутыль с тубусом или сифоном наливают исследуемую воду (3 - 5 л). Бутыль ставят выше колонки и вода самотеком стекает по сифону и присоединенной к нему резиновой трубке (тщательно прокипяченной в дистиллированной воде) в колонку с анионитом. Зажимом, надетым на трубку, регулируют подачу воды в колонку с таким расчетом, чтобы столбик смолы был постоянно под водой, но вода не протекала через край бюретки.

Загрязненную мутную воду целесообразно предварительно профильтровать через несколько слоев марли или стекловату.

    Перед  пропуском  воды через колонку  следует проверить ее pH и довести

его до 6,0 путем подкисления 0,25 М раствором KH PO  или HCl 1 N.

                                                2  4

    При  исследовании   водопроводной   воды   через   колонку   необходимо

пропустить  значительный  объем  воды  (10 - 15 л).  Для  этого  колонку  с

ионообменной  смолой подключают к водопроводному крану с помощью резинового

шланга и воду пропускают в течение всего рабочего дня. При этом соблюдаются

следующие  условия:  шланг,  соединяющий  водопроводный  кран  с  колонкой,

кипятят  в  течение  30  минут,  перед  началом  отбора  водопроводный кран

открывают на 15 минут,  после чего его обжигают большим факелом, а затем на

него  надевают  резиновый  стерильный  шланг,  второй  конец  шланга  также

обжигают и опускают в бюретку.  Подача воды уравновешивается с оттоком воды

из колонки.

    Элюцию  вируса со смолы производят  0,5 - 0,25 М  раствором  фосфатного

буфера с pH 8,0 - 8,2 (см. Приложение).  Для этого после  пропускания через

колонку  всего  исследуемого  объема  воды  бюретку  продувают  грушей  для

удаления  остатков  воды,  заливают  10  мл  указанного  буфера,  закрывают

резиновой  пробкой и тщательно  взбалтывают.  Буфер  оставляют в колонке со

смолой  на  1 - 2 часа при комнатной  температуре  или на 16 - 18 часов при

4 - 6 °C,  после  чего  производят  одномоментный  отбор всего элюата.  При

необходимости  длительного  хранения элюата целесообразно его pH довести до

7,0 - 7,2 путем подкисления 0,25 М раствором KH PO .

                                               2  4

Перед вирусологическими исследованиями к элюату, с целью его обеззараживания от бактериальной флоры, добавляют 2 - 3 мл эфира, тщательно перемешивают и во флаконе с ватной пробкой хранят в холодильнике при 4 - 8 °C в течение 3 - 4 суток до полного испарения эфира. После этого ватную пробку заменяют резиновой, материал замораживают и хранят при -15 - -20 °C до проведения вирусологических исследований.

 

г) Фильтрация через растворимые лантановые фильтры

 

Описываемый метод представляет собой комбинацию физических методов очистки и концентрации вирусов. Материал, исследуемый на наличие в нем вирусов, очищают методом двукратной фильтрации через стерилизующие целлюлозно-асбестовые фильтры (СФ) при отрицательном давлении (400 мл Hg), создаваемом с помощью вакуумного масляного насоса ВН-461М. Для исключения первичной адсорбции вирусов на бактериальном фильтре за счет разницы в электрических зарядах вирусов и пор фильтра, его предварительно обрабатывают 100 мл 0,05% водного раствора альгината натрия.

Растворимые лантан-алюминий-альгинатные ультрафильтры, употребляемые при ультрафильтрации, приготавливают следующим образом: фильтровальную бумагу, вырезанную по размеру диаметра фильтра Зейтца, хорошо пропитывают (каждый лист отдельно) смесью 0,5 М водных растворов азотнокислого лантана и хлористого алюминия в объемном отношении 2:1. Затем каждый фильтр, смоченный смесью этих электролитов, погружают в 1% раствор альгината натрия, после чего их немедленно (не более чем через 20 секунд) прополаскивают в дистиллированной воде. Последнее необходимо для защиты гелевой мембраны (толщиной примерно 0,4 мм), быстро образующейся на бумажном фильтре, от потери воды. После прополаскивания каждый ультрафильтр закладывают между двумя листами фильтровальной бумаги, снова погружают в дистиллированную воду и автоклавируют в течение 20 - 30 минут при 0,5 атм. Ультрафильтры до употребления необходимо хранить в той же стерильной воде при +4 °C.

Очищенный описанным выше способом от сопутствующих органических азотосодержащих веществ и микрофлоры вируссодержащий материал пропускают через фильтр Зейтца с растворимым лантан-алюминий-альгинатным ультрафильтром при отрицательном давлении - 700 мм ртутного столба. (Скорость ультрафильтраций 1 - 3 л очищенной воды через ультрафильтры диаметром 7,5 см составляет соответственно от 30 минут до 2 часов 30 минут.) По окончании процесса ультрафильтрации ультрафильтры извлекают, отделяют от фильтровальной бумаги гелевую мембрану с содержащимися на ней вирусами и растворяют ее в 1,0 - 2,5 мл 3,8% стерильного нейтрального раствора лимоннокислого натрия. Все эти манипуляции производят в асептических условиях. Для предохранения культуры ткани от возможного загрязнения, к очищенному и сконцентрированному описанными методами, вируссодержащему материалу добавляют антибиотики в обычно применяемых количествах (100 ед. пенициллина и 50 - 100 ед. стрептомицина на 1 мл) и оставляют на сутки при +4 °C. После 24-часового контакта с антибиотиками материал, содержащий вирусы, вносят в культуру ткани для выделения последних по цитопатическому действию или методом бляшек. Идентификация вирусов производится обычным методом. Если выделение вирусов тотчас же после ультрафильтрации невозможно, то ультрафильтр с содержащимся в нем материалом или его раствор в 3,8% лимоннокислого натрия хранят при минус 20 °C до проведения вирусологических исследований.

 

2. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБРАБОТАННЫХ ПРОБ

 

Выделение цитопатических энтеро- и аденовирусов

 

В целях наиболее полного выделения из проб группы цитопатических вирусов, его целесообразно проводить параллельно на двух видах культур ткани - первичной и перевиваемой.

В качестве первичной культуры ткани могут быть использованы клетки почек человека, фибробласты эмбриона человека, клетки почек обезьян.

Из перевиваемых линий можно рекомендовать клетки - ФК, Hep-2, HeLa, PM и др.

Заражение культуры ткани производят во флаконах емкостью 50 - 100 мл. В связи с тем, что исследуемый материал из объектов внешней среды зачастую обладает выраженным токсическим действием на культуру ткани, заражение рекомендуется производить следующим образом: после удаления питательной среды на монослой клеток наносится 0,5 - 1,0 мл исследуемой пробы и флакон помещают в термостат при 37 °C. После 30-минутного контакта вирусодержащего материала с клетками, пробу сливают и во флакон добавляют 10 мл поддерживающей среды. Зараженные культуры клеток инкубируют в термостате от 7 до 9 дней при выделении энтеровирусов и 15 - 17 дней - при выделении аденовирусов.

При отсутствии цитопатического действия на культуру ткани при первичном заражении проводят 2 слепых пассажа по общепринятой методике в пробирках с культурой ткани (не менее 2-х пробирок на каждое заражение). Результат считается отрицательным, если в обоих пассажах отсутствовал цитопатический эффект.

Идентификация выделенных цитопатических агентов производится по общепринятой методике с учетом того, что в пробах из объектов внешней среды может одновременно находиться несколько типов вирусов, что затрудняет их типирование.

Определение аденовирусов производится по характерному цитопатическому действию на культуру ткани ("гроздь винограда") и подтверждается в реакции связывания комплемента с антисывороткой. Нетипирующиеся цитопатические агенты также проверяются в этой реакции. Выделенные аденовирусы идентифицируются в реакции нейтрализации в культуре ткани с типовыми иммунными сыворотками.

 

 

 

 

 

Приложение

 

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ

ПАТОГЕННЫХ КИШЕЧНЫХ БАКТЕРИЙ И ВИРУСОВ

 

I. Для определения сальмонелл и шигелл

 

1. Приготовление магниевой среды. Магниевая среда в модификации Московского НИИ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

Готовят 3 раствора:

А. Пептона отечественного производства - 4,2 г;

хлористого натрия - 7,15 г;

    KH PO  - 1,43 г;

      2  4

дрожжевого диализата - 9,0 мл;

воды дистиллированной - 890,0 мл.

Б. Хлористого магния кристаллического - 35,7 г;

воды дистиллированной - 90,0 мл.

В. 0,5% водного раствора бриллиантового зеленого - 0,9 мл.

Смешивают, стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.

При посевах больших количеств исследуемого материала концентрацию всех ингредиентов, кроме дистиллированной воды, удваивают.

2. Среда с охмеленным суслом. Охмеленное сусло получают на пивоваренных заводах. В стерильной посуде охмеленное сусло, отобранное с соблюдением правил асептики, можно сохранять при температуре холодильника (+4 °C) в течение 3 - 4 недель.

 

Приготовление среды (ex Temporae)

 

I. 1. Охмеленное сусло - 100 мл.

2. Пептон (отечественный) - 5 г.

3. 20% р-р NaOH - 12 капель.

После перемешивания прокипятить на медленном огне в течение 10 минут. Остудить.

II. 0,1% водный раствор бриллиантгрюна.

 

Посев воды

 

В 0,5 л стерильную стеклянную посуду (мерные флаконы из-под питательных сред, используемых вирусологами) налить остуженное охмеленное сусло 100 мл, добавить 400 мл испытуемой воды. После этого добавить 7 - 9 мл 0,1% водного раствора бриллиантгрюна в зависимости от степени загрязнения исследуемой воды (для речной воды - 7 мл, для сточной - 9 мл). После тщательного перемешивания посев поставить в термостат для подращивания в течение 20 - 24 часов при температуре 37 °C.

III. Среда Левина с антибиотиком. На 1 л свежеприготовленной среды Левина (до застывания) добавляют 8 мл 0,5% раствора синтомицина или 4 мл 0,5% раствора левомицетина. После этого среду разливают на чашки.

 

II. Для выращивания холерных вибрионов

 

1. Пептонная вода. Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:

    Пептон                        - 100 г

    Хлористый натрий              - 50 г

    Азотнокислый калий            - 1 г

    Углекислый натрий             - 25 г

    Дистиллированная вода         - 1000 мл

    pH                            - 9,0

Смесь пептона с хлористым и углекислым натрием растирают в ступке, после чего растворяют в дистиллированной воде при кипячении; затем прибавляют азотнокислый калий. Раствор автоклавируют при 120 °C в течение 20 мин. (фильтрацию проводят до стерилизации). Основной раствор пептона (10% пептонная вода) сохраняется длительное время (до 6 месяцев).

Для получения 1% пептонной воды основной раствор пептона разводят в 10 раз, т.е. 1 объем основного раствора на 9 объемов дистиллированной воды. Полученную пептонную воду разливают в соответствующую посуду и стерилизуют, доведя предварительно pH до 8,8 - 9,0. Срок хранения 2 месяца.

2. Пептонная вода с теллуритом калия. В 1% пептонную воду после автоклавирования добавляют теллурит калия (калий теллуристокислый в конечном разведении 1:100000 или 1:200000). Среда готовится непосредственно перед употреблением или не ранее чем за сутки. Концентрацию теллурита калия желательно предварительно оттитровать на культуре холерного или нехолерного вибриона.

Примечание: Теллурит калия 2% раствор во флаконах по 5 мл выпускает Мосхимфармзавод им. Семашко.

 

Плотные среды

 

3. Щелочной агар (pH 7,8 - 8,0). К 1 литру нейтрального мясопептонного 2% агара или агара, приготовленного на переваре Хоттингера, прибавляют 30 мл 10% раствора углекислого натрия, кипятят 45 минут, фильтруют, разливают и стерилизуют в автоклаве 20 минут при 120 °C. Агар должен быть прозрачным. Срок хранения 3 месяца в прохладном месте.

4. Щелочная, таурохолатовая, теллуритовая, желатиновая, агаровая среда (среда Монсура оригинальная):

    Триптиказа                    - 10,0

    Хлористый натрий              - 10,0

    Таурохолат натрия             - 5,0

    Карбинат натрия               - 1,0

    Желатина Дифко                - 30,0

    Агар-агар                     - 15,0

    Дистиллированная вода         - до 1000 мл

    Полностью  растворить  хлорид  натрия и агар,  затем  желатину и другие

ингредиенты в кипящей водяной  бане при частом встряхивании.  Довести pH до

8,5,  разлить по 20 мл  в колбы с притертыми  пробками,  стерилизовать  при

1,5 атм.  15 минут.  Среду  хранить в прохладном месте. Перед разливом ее в

чашки  добавить  теллурит  калия  в  концентрации 1:200000, чашки со средой

можно использовать в течение 5 дней.

    5. Среда Монсура в модификации Т.Н. Донской и Л.Ф. Зыкина:

    Агар Хоттингера 1,5%          - 1000,0

    Желатина                      - 50,0

    Бычья желчь                   - 50,0

    pH устанавливают  7,4 - 7,6.  Стерилизуют  текучим паром или при 110 °C

15 минут. Перед разливкой добавляют теллурит калия в концентрации 1:100000.

    6. Бакто-агара ТСВ  -  сухая  среда  для  диагностики  холеры  (pH 8,6)

выпускается  фирмой  Дифко-Детроиз,  штат  Мичиган,  США.  Состав на 1 литр

дистиллированной воды:

    Дрожжевой экстракт            - 5 г

    Пептон                        - 10 г

    Цитрат натрия                 - 10 г

    Тиосульфат натрия             - 10 г

    Бычья желчь                   - 8 г

    Сахароза                      - 20 г

    Хлористый натрий              - 10 г

    Цитрат железа                 - 1 г

    Бромтимоловый синий           - 0,04

    Тимоловый синий               - 0,04

    Агар-агар                     - 15

На 1 литр дистиллированной воды берут 89 г сухой среды, нагревают до кипения (до полного растворения). Среду, не стерилизуя, разливают в чашки Петри.

7. Желчно-солевой агар. К мясопептонному агару (pH 8,0) добавляют 0,5 поваренной соли и 0,5% таурохолата натрия. Для подавления роста протея концентрацию таурохолата натрия можно повышать до 1%, стерилизуют при 110 °C 15 минут.

8. Агар Дьедонне. Приготовляется смесь равных объемов стерильно собранной дефибринированной крови барана, быка или лошади и нормального раствора едкого калия. Стерилизуют при 100 °C в течение получаса. 3 части этой смеси щелочного альбумината тщательно смешивают с 7 частями расплавленного и охлажденного до 45 °C мясопептонного 3% агара нейтральной реакции и разливают в чашки Петри. Ввиду того, что свежеприготовленная среда содержит аммиак, вредно действующий на рост холерных вибрионов, перед употреблением ее нужно выдерживать при 37 °C в течение 24 часов.

9. Среда Аронсона типа Эндо. Содержит сбраживаемый углевод и обесцвеченный фуксин. Окраска фуксина восстанавливается в присутствии промежуточных альдегидов, образующихся в процессе ферментации сахарозы.

Способ приготовления: мясопептонный 3% агар проваривают в течение 4 - 5 часов в аппарате Коха. К 100 мл горячей воды добавляют 5 - 6 мл 100% раствора безводной углекислой соды и стерилизуют 10 - 15 мин. при 100 °C, после чего к 100 мл горячей среды добавляют 5 мл 20% раствора сахарозы и 5 мл 20% раствора декстрина, предварительно простерилизованных в автоклаве или фильтрацией, 0,4 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл свежеприготовленного раствора сульфита натрия, предварительно простерилизованного кипячением. Готовую среду, остуженную до 45 - 50 °C, разливают по чашкам. Через 10 - 15 часов роста колонии холерного вибриона на этой среде имеют ярко-красный центр и бледно-розовую или бесцветную периферию.

Среду Аронсона можно приготовить упрощенным методом. Для этого к 100 мл расправленного охлажденного 2% агара Хоттингера (pH 7,8 - 8,0), аминного азота 150 мг% добавляют 1,5 г сахарозы, 0,05 - 0,06 мг витамина B1, желательно от 0,3 мл до 0,5 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 100 мл водного раствора сернокислого натрия (сульфита натрия) до обесцвечивания (около 3 - 5 мл). Охлаждают до 45 - 50 °C, разливают в чашки и подсушивают.

10. Лактозо-сахарозная (полууглеводная) среда. Среду готовят по следующей прописи:

    Пептона                       - 0,5 г

    Поваренной соли               - 0,5 г

    Лактозы                       - 1,0 г

    Сахарозы                      - 0,1 г

    Агар-агара                    - 1,0 г

    Индикатора Андреде            - 4 мл

    Воды дистиллированной         - 100 мл

    pH                            - 7,4

Готовая среда после стерилизации окрашивается как среда Ресселя и посев на нее производится по общепринятой методике.

Холерные и холероподобные вибрионы расщепляют сахарозу, дают покраснение среды в столбике без образования газа. Дизентерийные, тифо-паратифозные бактерии, а также faecalis alcaligenes не изменяют цвет среды. Кишечная палочка образует кислоту с газом как в столбике, так и в скошенном участке среды.

 

Для определения возбудителей туляремии

 

Среда Мак-Коя. Стерильно смешивают желток свежих куриных яиц с физиологическим раствором в пропорции 3:2; смесь разливают в стерильные пробирки (по 4 - 5 мл в каждую) и в скошенном положении выдерживают в течение часа при 80 °C. Готовую среду ставят на сутки в термостат при 37 °C для проверки ее стерильности, затем сохраняют на холоде для предотвращения высыхания.

 

Дифференциально-диагностические среды и реактивы

для определения энтеропатогенных кишечных палочек

 

1. Агар Эндо и агар Плоскирева готовят на выпускаемых в СССР сухих средах Эндо и Плоскирева в соответствии с наставлением, прилагаемым к препаратам.

2. Трехсахарный агар (для определения продуцирования сероводорода):

    Мясная вода                                      - 1000 мл

    Дрожжевой экстракт                               - 3,0 г

    Пептон (семипалатинский)                         - 20,0

    Хлористый натрий                                 - 3,5 г

    Лактоза                                          - 10,0 г

    Сахароза                                         - 10,0 г

    Агар-агар (корсаковский, японский или Дифко)     - 15,0 г

    Устанавливают  pH = 7,1 при помощи 20%  раствора  гидрата окиси натрия,

фильтруют,  стерилизуют  в  автоклаве  30  мин.  при  1  атмосфере.   Затем

добавляют:

    Fe SO  x 7H O                                    - 0,2 г

      2  4     2

    Гипосульфит натрия (Na SO )                      - 0,3 г

                          2  3

    Глюкозу                                          - 1,0 г

    0,2% водный раствор фенолрот                     - 12 мл

    Среду  разливают в стерильные  бактериологические  пробирки  по  7 мл и

стерилизуют текучим паром 20 мин.

    При выращивании  бактерий,  продуцирующих  сероводород, на дне пробирки

появляется черное окрашивание.

    3. Агар Клиглера:

    Мясная вода                                      - 1000 мл

    Протеозопептон                                   - 20,0 г

    Хлористый натрий                                 - 5,0 г

    Na SO                                            - 0,4 г

      2  3

    Na S O  x 5H O                                   - 0,08 г

      2 2 3     2

    Агар-агар                                        - 20,0 г

    Кипятят,  устанавливают pH = 7,8,  снова кипятят, фильтруют и добавляют

следующие реактивы:

    Лактоза                                          - 10,0 г

    Глюкоза                                          - 1,0 г

    F SO  x 7H O (растворить предварительно          - 0,5 г

     2  4     2

    в небольшом количестве воды)

    Фенолрот (0,2% раствор в 50% этиловом спирте)    - 12 мл

    Разливают  в  бактериологические  пробирки  и  стерилизуют  в автоклаве

20 мин.

    При  выращивании  бактерий,  образующих  сероводород,  на  дне пробирки

появляется черное окрашивание.

    4. Среда с мочевиной (по Преусу):

    Стерильный 1,7% агар на мартеновском бульоне     - 1000 мл

    Глюкоза                                          - 5,0 г

    50% раствор мочевины                             - 20 мл

    0,2% раствор бромтимолблау                       - 12 мл

    Среду  разливают в стерильные бактериологические пробирки по 5 - 7 мл и

стерилизуют текучим паром 15 мин.

    При  выращивании  бактерий,  расщепляющих  мочевину,  появляется  синее

окрашивание  (положительный  результат).   При  отрицательном  результате -

окрашивание желтое.

    5. Среда Симмонса:

    Вода дистиллированная                            - 1000 мл

    (NH ) HPO                                        - 1,5 г

       4 2   4

    KH PO                                            - 1,0 г

      2  4

    MgSO  x 7H O                                     - 0,2 г

        4     2

    Натрий лимоннокислый                             - 3,0 г

    Агар-агар (корсаковский, японский, Дифко)        - 20,0 г

    Устанавливают  pH = 7,2  при  помощи 10% раствора гидрата окиси натрия,

добавляют  10  мл  0,2%  раствора  бромтимолблау,  разливают  в  стерильные

бактериологические  пробирки по 7 мл  и стерилизуют в автоклаве  при 112 °C

15 мин.

    Утилизирующие  цитрат  натрия  бактерии  дают  на  среде хороший рост и

изменяют  ее  окраску  в  синий   цвет   (положительный   результат).   При

отрицательном результате окраска среды не изменяется и отсутствует заметный

рост бактерий.

    6. Индикаторная бумажка на индол:

    Пара-диметиламинобензоальдегид                   - 5,0 г

    Спирт 96°                                        - 50,0 мл

    Фосфорная кислота (очищенная, концентрированная) - 10,0 г

Растирают в фарфоровой ступке. Полученным раствором смачивают край (1 - 2 см) ленты фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают тонкими полосками. Бумажку с реактивом вставляют в пробирку, прижимая пробкой.

В присутствии индола желтоватый цвет пропитанного реактивом участка бумаги меняется на розовый (до малинового).

 

Метод определения цитопатического действия

в культуре ткани

 

В качестве объекта заражения могут быть использованы клетки перевиваемых линий и первично-трипсинизированные клетки. Для заражения используют 3-суточную однослойную культуру в пробирках. Заражение производится из расчета 1 млрд. бактериальных клеток изучаемой культуры на 1 мл питательной среды, в которой происходит культивирование клеток ткани. Рекомендуется заражать одним и тем же штаммом не менее 3-х пробирок для получения достоверных данных. Контролем служит незараженная ткань, а также пробирки с тканью, зараженной вульгарной непатогенной кишечной палочкой в той же концентрации (1 млрд. на 1 мл питательной среды). Зараженный монослой инкубируют при 37 °C в течение 18 - 20 часов, результат просматривают с помощью микроскопа с малым увеличением. В положительных случаях наблюдается полное или частичное разрушение монослоя. В контрольных пробирках должна быть неизменная ткань клеток.

Предварительными исследованиями установлено, что вирулентные культуры патогенных бактерий сохраняют способность вызывать цитопатическое действие в культуре ткани.

 

Для обнаружения палочек сибирской язвы

 

Обработка мембранных фильтров

 

Новые мембранные фильтры в течение суток промывают в проточной водопроводной воде, затем высушивают на фильтровальной бумаге, раскладывая по 1 штуке. Мембранные фильтры перед посевом стерилизуют кипячением в трижды сменяемой дистиллированной воде по 20 - 30 минут. Необходимо фильтры для кипячения опускать в предварительно нагретую воду во избежание скручивания мембранных фильтров. В последней воде мембранные фильтры хранят до следующего употребления.

Среда ГКИ (Государственного Контрольного Института)

Среда состоит из раствора Хенкса, используемого для поддержания культуры тканей, с добавлением 40% стерильной бычьей сыворотки, предварительно инактивированной при 56 °C в течение 30 минут. Если не имеется жидкости Хенкса, можно пользоваться бульоном, изготовленным на переваре Хоттингера, к которому добавляют стерильно 40% инактивированной бычьей сыворотки. Среду доводят с помощью двууглекислой среды до pH = 7,2 - 7,4. Пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками.

 

К санитарно-вирусологическим исследованиям

 

1. Приготовление 0,5 М фосфатного буфера

 

    Раствор   N  1 - 0,5 М   Na HPO   -  89,0  г  на   1 л.  Для  получения

                               2   4

двухзамещенного   фосфорнокислого   натрия,    содержащего   две   молекулы

кристаллизационной  воды,   соль   предварительно   растирают  в  ступке  и

высушивают на воздухе 2 - 3 суток до постоянного веса.

    Раствор  N  2 - 0,5 М KH PO   - калий  фосфорнокислый  однозамещенный -

                            2  4

68,06 г на 1 л.

Для получения фосфатного буфера с pH = 8,2 берут 96,5 мл раствора N 1 и 3,5 мл раствора N 2. С целью стерилизации приготовленный буфер фильтруют через мембранный (N 2) или асбестовый фильтр.

 

2. Приготовление лантановых фильтров

 

а) Водные растворы (0,05% и 1%) технического альгината натрия (полученного с Архангельского водорослевого комбината) приготавливают энергичным встряхиванием и продолжительным набуханием (24 часа) его в воде.

Полученную гелеобразную жидкость желтого цвета очищают от примесей фильтрованием через вату и хранят при температуре +4 °C не более месяца.

б) Водные растворы электролитов

    0,5 М р-р Na(NO )  x 6H O х.ч. - (216,5 г на 1 л воды)

                   3 3     2

    0,5 М р-р AlCl  x 6H O х.ч. кристаллический (120,8 г на 1 л воды)

                  3     2

в) 3,8% нейтральный водный раствор лимоннокислого натрия

Трехзамещенный лимоннокислый натрий растворяют в воде на водяной бане. Все растворы готовят на стерильной дистиллированной воде.