"Методическое указание по обнаружению, идентификации и количественному определению афлатоксинов в некоторых пищевых продуктах (пшеница, рис, соя)"

| На главную | Контакты | Поиск на текущей странице: "Ctr+F" |

Содержание библиотеки:

Комментарии пользователей / оставить комментарий >>>

Утверждаю

Заместитель Министра

здравоохранения СССР -

Главный государственный

санитарный врач СССР

П.Н.БУРГАСОВ

12 мая 1974 г. N 1157-74

МЕТОДИЧЕСКОЕ УКАЗАНИЕ

ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОМУ

ОПРЕДЕЛЕНИЮ АФЛАТОКСИНОВ В НЕКОТОРЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(ПШЕНИЦА, РИС, СОЯ)

Разработано Институтом питания АМН СССР.

Последние годы характеризуются все возрастающим вниманием органов здравоохранения к продуктам жизнедеятельности некоторых микроскопических грибов - микотоксинам. Многие из них обнаружены в неправильно хранящихся продуктах питания. Особое внимание было привлечено к группе афлатоксинов, которые стали объектом интенсивного изучения сравнительно недавно. Интерес к этой группе ядов обусловлен обнаружением у них сильнейших гепатотоксических и гепатоканцерогенных свойств, а также широким распространением их продуцентов, относящихся, главным образом, к роду Aspergillus, в пищевых продуктах растительного происхождения. В настоящее время установлено, что многие продукты питания и корма (преимущественно в странах тропического пояса) могут содержать опасные концентрации афлатоксинов. Так, например, афлатоксины обнаружены в арахисе и арахисовых продуктах, кокосовых орехах, пшенице, рисе, сорго, маисе и даже кофе. Имеются единичные сообщения об открытии афлатоксинов в хлебе, сыре, вине и некоторых других продуктах.

Следует отметить, что зараженность одних и тех же продуктов афлатоксинами значительно отличается в разных географических областях и колеблется в зависимости от сезона и других факторов.

Некоторые сведения, выбранные из обширной литературы о загрязненности афлатоксинами пищевых продуктов в странах Юго-Восточной Азии и Африки, суммированы в таблице 1.

Таблица 1

ДАННЫЕ О СОДЕРЖАНИИ АФЛАТОКСИНОВ

В ЗАРАЖЕННЫХ ОБРАЗЦАХ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

(ПО ДАННЫМ ДЛЯ СТРАН ЮГО-ВОСТОЧНОЙ АЗИИ И АФРИКИ)

┌───────────────────────────────┬────────────────┬───────┬────────────────┐

│ Продукты питания │ Общее │Процент│ Страна │

│ │ содержание │обнару-│ │

│ │ афлатоксинов │жения │ │

│ │ (мкг/кг) │ │ │

├───────────────────────────────┼────────────────┼───────┼────────────────┤

│Арахис │1530 <1> │49,0 │Таиланд, Гонконг│

│ Ядра арахиса │до 430 (B ) <2> │ │Тайвань │

│ │ 1 │ │ │

│ Масло арахисовое │до 260 (B + B )│ │Индия │

│ │ 1 2 │ │ │

│ │<3> │ │ │

│ Жир арахисовый │до 730 (B ) <2> │ │Тайвань │

│ │ 1 │ │ │

│ Сладости арахисовые │до 329 <4> │62 - │Таиланд │

│ │ │66,0 │ │

│ Вареный арахис │до 6500 <4> │ │Таиланд │

│Зерновые культуры │400 <1> │35,0 │Таиланд, Гонконг│

│Просо │67 <1> │11,0 │Таиланд, Гонконг│

│ │до 100 <5> │16,4 │Уганда │

│Бобовые (соя, кофе, горох) │215 <1> │3,0 │Таиланд, Гонконг│

│ │до 1000 <5> │71,9 │Уганда │

│Рис │20 <1> │2,0 │Таиланд, Гонконг│

│ Рис заплесневелый │до 230 <2> │ │Тайвань │

│Саго │150 <1> │3,0 │Таиланд, Гонконг│

│Кукуруза │до 1000 <5> │44,9 │Уганда │

│Сорго │до 1000 <5> │37,7 │Уганда │

│Маниок │до 1000 <5> │11,9 │Уганда │

│Готовые продукты питания: │ │ │ │

│ сушеные фрукты, конфеты, │510 <1> │6,0 │Таиланд, Гонконг│

│ печенье, сахар, жиры, марино-│ │ │ │

│ ванные овощи, соусы, уксус, │ │ │ │

│ джин, порошковое молоко, │ │ │ │

│ хлеб, яйца │ │ │ │

│Продукты, приготовленные в виде│до 355 <4> │ │Таиланд │

│блюд │ │ │ │

│Сушеная рыба (креветки) │166 <1> │5,0 │Таиланд, Гонконг│

│Перец │125 <1> │11,0 │Таиланд, Гонконг│

│Овощи свежие │30 <1> │1,0 │Таиланд, Гонконг│

│Чеснок, лук │67 <1> │3,0 │Таиланд, Гонконг│

│Кунжут, семена │меньше 1 <1> │3,0 │Таиланд, Гонконг│

│Вино, пиво │меньше 1 мкг/л │ │Кения │

│ │<6, 7> │ │ │

└───────────────────────────────┴────────────────┴───────┴────────────────┘

Необходимо подчеркнуть, что загрязнение пищевых продуктов афлатоксинами наиболее характерно для тех районов Африки и Азии, где сравнительно часто встречается первичный рак печени (Lopes, Crawford, 1967; Wilson, 1967; Tung, Ling, 1969; Alma и др., 1970, 1971; Kumar, Sampath, 1971; Alpert и др., 1971).

Выяснение химической структуры (рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся) и физических свойств афлатоксинов послужило основой для разработки ряда методов выявления и количественного определения содержания этих токсических веществ, что вызвано необходимостью осуществления эффективного контроля за обнаружением минимально допустимых количеств их в пищевых продуктах.

Все существующие методы, несмотря на некоторые отличия, включают следующие общие стадии:

1. Отбор образцов для анализа.

2. Обезжиривание (применяется только для продуктов, содержащих более 15% жира, например, соя).

3. Экстракция афлатоксинов.

4. Дополнительные процедуры очистки, характер которых зависит от анализируемого продукта.

5. Обнаружение и идентификация афлатоксинов по специфической флуоресценции в ультрафиолетовом свете (сине-фиолетовой у афлатоксинов группы B и желто-зеленой у афлатоксинов группы g, а также по величинам Rf на пластинах с тонким слоем какого-либо сорбента (различные марки силикагеля с размером частиц порядка 150 - 190 меш).

6. Количественное определение содержания афлатоксинов с помощью спектрофотометрических, флуороденситометрических, а также визуальных методов.

При исследовании образцов пищевых продуктов, содержащих большое количество жира, проводят предварительное обезжиривание растворителями типа гексана или петролейного эфира, а затем осуществляют экстракцию афлатоксинов и остатка жира из образца полярным растворителем с последующей очисткой экстракта афлатоксинов с помощью активированного угля, карбоната меди или целитов. В большинстве случаев после этого производят дополнительную очистку афлатоксинового экстракта от остатков жира на хроматографических колонках с различными типами сорбентов (табл. 2), применяя при этом комбинации соответствующих растворителей для элюирования афлатоксинов.

Таблица 2

ТИПЫ СОРБЕНТОВ И СИСТЕМА ЭЛЮЕНТОВ,

ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ ОЧИСТКЕ И РАЗДЕЛЕНИИ АФЛАТОКСИНОВ

НА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНКАХ

Тип сорбента	Элюент или система элюентов
Силикагели различных марок с размером частиц, не превышающим 100 - 200 меш	Хлороформ Хлороформ + этанол (99 + 1) Хлороформ + этанол (99,9 + 0,1) или (99,4 + 0,6) Хлороформ, затем метанол Хлороформ + метанол (99,75 + 0,25) Хлороформ, затем хлороформ + метанол (95 + 5) Хлороформ + ацетон + этанол (97,3 + 2 + 0,7) Бензол + метанол (98,25 + 1,75)
Целит	Гексан, затем хлороформ
Флоризид	Тетрагидрофуран, затем хлороформ
Целлюлоза	Гексан, затем гексан + хлороформ (1 + 1)
Сефадекс-10 с карбоксиметильны- ми группами	Вода
Кремниевая кислота	Хлороформ + этанол (99 + 1)
Адсорбосил-5	Хлороформ + бензол (1 + 1), затем хлороформ + метанол (98 + 2), затем метанол
Окись алюминия кислая	Бензол + хлороформ (5 + 1)
Окись алюминия по Брокманну основная с 6,25% дигидрата щавелевой кислоты	Бензол, затем бензол + хлороформ (1 + 1), затем хлороформ + метанол (90 + 10)

Очищенный от жира экстракт афлатоксинов подвергают анализу на пластинах с тонким слоем сорбента с целью обнаружения и идентификации афлатоксинов, после чего определяют их содержание в исследуемом образце.

Обращаем внимание (табл. 2), что предлагаемые способы очистки афлатоксинов на хроматографических колонках требуют, как правило, применения нескольких последовательных хроматографических ступеней со сменой систем растворителей в процессе элюирования.

В связи с тем, что в СССР поступают некоторые продукты из стран, в

которых афлатоксины имеют широкое распространение, в Институте питания АМН

СССР на протяжении последних 6 лет ведутся систематические исследования по

изучению распространения афлатоксинов, выяснению механизма их действия, а

также по разработке методов обнаружения, идентификации и количественного

определения афлатоксинов в пищевых продуктах (А.А. Покровский и др., 1969,

1970, 1971; М.Я. Николаева и др., 1971; В.П. Богородицкая, Н.П. Нефедьева,

1972). В результате был разработан метод обнаружения, идентификации и

количественного определения содержания афлатоксина B (наиболее сильного из

всех известных гепатоканцерогенов) в некоторых продуктах, а именно в

пшенице, рисе, сое.

К выгодным особенностям метода относятся сравнительная простота

выполнения анализа, полная экстракция афлатоксинов (благодаря предложенной

системе растворителей), а также сокращение процедуры очистки

афлатоксинового экстракта от остатка жира на хроматографической колонке (за

счет рационального подбора сорбента и системы растворителей при

элюировании). Чувствительность данного метода позволяет осуществлять

контроль за обнаружением минимально допустимых количеств афлатоксина B в

указанных продуктах. Максимальная длительность анализа составляет около 8

час. <1>. Оснащение и общие методические приемы техники производства

серийных анализов в исследуемых образцах муки, приготовленной из зерна

пшеницы, риса и сои, приводятся в настоящем Методическом письме.

--------------------------------

<1> Время проведения анализа может быть значительно уменьшено в случае отсутствия стадии обезжиривания и очистки на колонке, а также за счет стадии экстракции, экстракт можно приготовить заранее, заливая навеску муки растворителем на ночь при комнатной температуре.

1. Экстракция афлатоксинов из образца

Если исследуемый образец содержит высокий процент жира, то анализ следует начинать со стадии обезжиривания.

Оборудование и материалы <2>

--------------------------------

<2> Перечень оборудования здесь и далее дан в расчете на проведение минимум одного анализа. Указанное же количество реактивов является необходимым и достаточным для обработки десяти проб.

1. Шкаф сушильный (МРТУ 42-1411-61, тип 2В-151).

2. Мельница ЭМ-ЗА (З-д лабоборудования, Одесса).

3. Сито N 0,8, изготовленное из металлической сетки, для мукомольной промышленности (ГОСТ 3924-47).

4. Шпатель металлический или ложка фарфоровая.

5. Весы технические.

6. Штативы Бунзена.

7. Колба одногорлая круглодонная на 500 мл с н.ш. (нормальный шлиф) N 29.

8. Холодильник шариковый обратный с н.ш. N 29.

9. Трубка резиновая с внутренним диаметром 5 мм.

10. Трубка резиновая вакуумная с внутренним диаметром 5 мм.

11. Цилиндры мерные на 25 и 200 мл.

12. Баня водяная лабораторная электрическая (МРТУ N 42-886-63).

13. Термометр 0 - 100 °С.

14. Лабораторный автотрансформатор (ЛАТР).

15. Насос водоструйный.

16. Пипетка Пастера или капилляр.

17. Гексан нормальный (х.ч.) или петролейный эфир (фракция 40 - 60°) (ч.д.а.) - 1,5 л.

18. Хлороформ медицинский - не менее 4,5 л.

19. Вода дистиллированная - 0,2 л.

Зерно высушивают в сушильном шкафу при 60 - 70 °С до постоянного веса и навеску в 35 г измельчают на мельнице ЭМ-ЗА в течение 3 - 4 мин., после чего просеивают через сито N 0,8.

В случае необходимости проводят обезжиривание образца. Для этого из просеянной муки берут навеску, равную 30 г, помещают в круглодонную колбу на 500 мл и приливают 150 мл гексана или петролейного эфира. Колбу соединяют с обратным шариковым холодильником и нагревают на водяной бане (вода должна быть нагрета до температуры, обеспечивающей закипание растворителя в колбе, регулирование нагрева осуществляют при этом с помощью ЛАТРа). Экстракцию жира проводят в течение 60 мин.: в течение этого периода из образца извлекается 90% всех липидов, экстрагируемых этими растворителями. После обезжиривания образца колбу отсоединяют и осторожно отсасывают гексановый раствор жира пастеровской пипеткой, соединенной с водоструйным насосом.

К подготовленному для извлечения афлатоксинов образцу (обезжиренному или необезжиренному) (30 г) приливают 150 мл азеотропной смеси (вода + хлороформ - 2,5 + 97,5%) по весу; температура кипения 56,1 °С. Затем проводят экстракцию афлатоксинов в таких же условиях, как и обезжиривание. Экстракцию продолжают в течение 1 часа.

2. Фильтрование, обезвоживание и очистка экстракта

афлатоксинов. Оборудование и материалы

1. Стеклянный пористый фильтр N 1.

2. Бумага фильтровальная (мягкая, широкопористая, быстро фильтрующая; для грубых осадков).

3. Ножницы.

4. Колба коническая на 100 мл с н.ш. 14,5 с притертой пробкой.

5. Целит (85 - 100 меш) или АСК (алюмосиликатный катализатор) - 20 г.

6. Натрий сернокислый безводный (х.ч.) - 30 г.

Экстракт афлатоксинов осторожно декантируют через стеклянный пористый фильтр N 1 с помещенными на его поверхности вырезанным кружком фильтровальной бумаги (с диаметром, равным диаметру фильтра), а также с порошком целита (или алюмосиликатного катализатора) и безводного сульфата натрия (по 2,0 г каждого), собирая фильтрат в коническую колбу на 100 мл. Фильтр промывают тремя порциями (по 5 мл) хлороформа.

Колбу закрывают пробкой и сохраняют в темноте. В полученном профильтрованном декантате, объем которого составляет примерно 100 мл, содержится около 2/3 от общего содержания афлатоксинов в исходной навеске исследуемого образца. Таким образом, 100 мл фильтрата соответствуют 20 г образца.

3. Удаление растворителя из экстракта афлатоксинов

после фильтрования, обезвоживания и очистки.

Оборудование и материалы

1. Микроприспособление для отгонки растворителя в токе азота (рис. 2) с запасными пробирками на 5 мл с н.ш. N 14,5 с притертыми пробками.

2. Пипетка измерительная на 5 мл.

3. Баллон со сжатым азотом или, при его отсутствии, ротационный испаритель, либо водоструйный насос.

К колбе, содержащей фильтрат афлатоксинового экстракта, присоединяют насадку от приспособления, изображенного на рис. 2. Насадка снабжена патрубком для подачи азота из баллона и специальным отводом для удаления паров растворителя. Колбу слегка нагревают на водяной бане примерно до температуры воды бани 30 °С и пропускают через насадку азот с умеренной скоростью.

После удаления растворителя в колбу добавляют пипеткой 3 мл хлороформа порциями по 1 мл, остатки афлатоксинового экстракта смывают в пробирку на 5 мл с н.ш. N 14,5, осуществляя таким образом количественное перенесение экстракта. С помощью указанной выше насадки, которую присоединяют к пробирке, снова удаляют весь растворитель, как было описано выше. После удаления растворителя пробирку плотно закрывают притертой пробкой и сохраняют до проведения дальнейшей стадии анализа в темноте.

4. Хроматографическая очистка

афлатоксинового экстракта на колонке

Если исследуемый образец подвергался предварительному обезжириванию, осуществляют очистку полученного афлатоксинового экстракта на хроматографической колонке с нейтральной окисью алюминия II степени активности по Брокманну.

Не требуют хроматографической очистки образцы, не подвергавшиеся предварительному обезжириванию, т.е. образцы продуктов, содержащие менее 5% жира.

Оборудование и материалы

1. Колонка хроматографическая (300 х 25 мм), снабженная на выходе пористым стеклянным фильтром N 1 и краном, а в верхней части имеющая резервуар (объемом не менее 500 мл) и кран.

2. Колбы конические плоскодонные (объемом 250 мл) с нормальными шлифами и притертыми пробками.

3. Колба перегонная с верхним тубусом (объемом не менее 200 мл) с нормальным шлифом.

4. Насадка к перегонной колбе с капилляром и нормальным шлифом (для подачи азота).

5. Холодильник Либиха (но менее 300 мм длиной) с нормальными шлифами.

6. Аллонж с нормальными шлифами.

7. Аппарат для флуоресцентного анализа витаминов в растворах (модель 833 МРТУ 42-1080-63, Производственное объединение "Красногвардеец") с приставкой, предложенной авторами (раздел 5, рис. 3).

8. Окись алюминия нейтральная по Брокманну II степени активности: "Reanal", для хроматографии - 1 кг.

9. Бензол для криоскопии (или х.ч.) - 6,5 л.

В хроматографическую колонку на фильтр помещают 1 г безводного сульфата натрия, а затем вносят суспензию окиси алюминия в бензоле, добиваясь заполнения всей колонки сорбентом при плотной упаковке последнего. Упаренный афлатоксиновый экстракт, приготовленный для проведения дальнейшей стадии анализа, растворяют в минимальном объеме подогретого до 60 °С хлороформа и наносят на поверхность окиси алюминия сразу же после впитывания бензола. Элюирование проводят в темной комнате при непрерывной подаче смеси бензола с хлороформом (5:1, по объему), наливаемой в верхний резервуар колонки.

Собирают фракции элюата в конические колбы объемом 250 мл,

периодически наблюдая за продвижением флуоресцирующей сине-фиолетовой зоны

афлатоксинов B и B и желто-зеленой зоны афлатоксинов g и g с помощью

1 2 1 2

источника ультрафиолетового излучения - аппарата для флуоресцентного

анализа витаминов в растворах. Элюирование заканчивают, когда указанные

флуоресцирующие зоны полностью перейдут во фракции элюата.

Содержащие афлатоксины фракции элюата переносят в круглодонную колбу на 200 - 500 мл и производят отгонку растворителей на водяной бане, используя насадку с капилляром для подачи азота из баллона, холодильник Либиха и аллонж. Смесь хлороформа и бензола собирают в приемную колбу (коническую на 250 мл с нормальным шлифом); при отгонке растворителей не рекомендуется доводить до кипения воду бани.

Очищенную от примесей суммарную афлатоксиновую фракцию количественно с помощью хлороформа переносят в пробирку микроприспособления, удаляют весь растворитель в токе азота, как указывалось выше, пробирку закрывают пробкой и сохраняют в темноте.

5. Разделение афлатоксиновой фракции на индивидуальные

соединения хроматографией в тонком слое и их идентификация.

Оборудование и материалы

1. Мельница шаровая с фарфоровыми шарами или ступка фарфоровая с пестиком (N 5).

2. Капроновая сетка N 73 и 76 (Рахмановский шелковый комбинат, Московская область, г. Павловский Посад). Капроновую сетку натягивают на алюминиевые каркасы диаметром 20 см; каркасы, поддон и крышку используют от сит стандартного алюминиевого набора.

3. Пипетки измерительные на 0,1; 0,2; 1 и 10 мл.

4. Ступка фарфоровая с пестиком (N 1).

5. Пластинки фотографические (9 х 12) со снятой эмульсией.

6. Стеклянный четырехугольный сосуд с размерами по внутреннему диаметру 195 х 195 х 200 мм (завод "Дружная горка", ст. Сиверская Ленинградской обл.).

7. Стекло со шлифованной поверхностью 20 х 20 см.

8. Колба мерная на 100 мл с притертой пробкой.

9. Металлическая приставка (220 х 125 мм), крепящаяся стационарно к передней панели аппарата для флуоресцентного анализа витаминов в растворах (рис. 3). Фиксация приставки осуществляется нижними винтами, крепящими рамку фильтра вплотную к нижнему его краю под углом в 60° к его поверхности. Приставка служит для просматривания пластин с тонким слоем сорбента в ультрафиолетовом свете.

10. Кизельгель Н ("Marck", 10 - 40 мк) или силикагель ЛС с 13% гипса ("Chemapol", 5 - 40 мк) - 30 г, или силикагель КСК-3 - 100 г Башкирского химкомбината N 18 (г. Салават). База комбината: Москва, Лианозово, Заводская ул., д. 3.

11. Гипс медицинский - 5 г.

12. Ацетон (х.ч.) - 0,1 л.

13. Изопропиловый спирт (2-пропанол), х.ч., - 0,02 л.

Если в наличии не имеется кизельгеля Н или силикагеля ЛС, не требующих предварительной подготовки, используют силикагель КСК-3, который измельчают либо в шаровой мельнице, либо в фарфоровой ступке N 5. Для приготовления тонкого слоя наиболее подходящей является фракция силикагеля 180 - 200 меш (5 - 15 мин.), собираемая между капроновыми ситами N 73 и 76.

2,7 г кизельгеля Н, силикагеля ЛС или фракции силикагеля КСК-3 180 - 200 меш (с 8% гипса) помещают в ступку N 1, добавляют 6 - 7 мл воды и интенсивно перемешивают смесь пестиком в течение 60 сек. На фотографическую пластинку, освобожденную от эмульсии, выливают суспензию и, осторожно придерживая пластинку за края, добиваются ровного растекания суспензии по стеклу. Пластинку помещают на горизонтальную поверхность до высыхания (около 6 - 10 часов), после чего непосредственно перед проведением анализа ее в вертикальном состоянии помещают в сушильный шкаф на 1 час при 110 °С. Толщина получаемого тонкого слоя сорбента при данных условиях составляет около 500 мк.

Отмечают линию старта на расстоянии 2 см от нижнего края узкой стороны пластины (9 см), а также границу линии фронта смеси растворителей (11 см вверх от нижнего края пластины).

В пробирку с суммарной афлатоксиновой фракцией добавляют 3 раза по 3 мл хлороформа, переносят количественно порциями раствор в мерную колбу на 100 мл, доводя объем в колбе до 100 мл хлороформом <1>, и наносят на линии старта соответствующими пипетками 180, 60 и 30 мкл полученного основного раствора. В стеклянный четырехугольный сосуд наливают смесь: хлороформ + ацетон + 2-пропанол (41,2 + 9 + 1,5 мл). Пластину наклонно помещают в этот сосуд и закрывают его стеклом со шлифованной поверхностью. Хроматографирование проводят в темноте (недопустимо воздействие ультрафиолетового света). Когда растворитель поднимается по пластинке на отмеченную заранее высоту (11 см от начала пластины), пластину осторожно вынимают, слегка просушивают на воздухе до полного исчезновения запаха растворителей и просматривают в темной комнате под ультрафиолетовым светом, источником которого является ртутно-кварцевая лампа ПРК-4, вмонтированная в аппарат для флуоресцентного анализа витаминов в растворах.

--------------------------------

<1> Полученный основной раствор (100 мл) соответствует 20 г образца.

Мощность указанной горелки составляет 200 Вт при напряжении сети 120 В.

Ультрафиолетовое излучение, обеспечиваемое лампой ПРК-4, проходит через

фильтр УФС-6, также вмонтированный в данный аппарат; в этих условиях

наименьшим коэффициентом поглощения характеризуется область

ультрафиолетового спектра, соответствующая 360 нм. Таким образом

достигается оптимальный режим для наблюдения флуоресценции афлатоксинов.

Обнаружение на пластине, помещаемой на специальную приставку,

сине-фиолетового пятна с Rf порядка 0,66 свидетельствует о наличии в

исследуемом образце афлатоксина B . Аналогично выявление на пластине пятна

с желто-зеленой флуоресценцией с Rf порядка 0,55 обусловлено присутствием в

образце афлатоксина g <*>.

--------------------------------

<*> В сомнительных случаях рекомендуется провести повторное хроматографирование в диэтиловом эфире: афлатоксины остаются на прежних местах, а афлатоксиноподобные вещества уйдут с фронтом растворителя.

6. Количественное определение содержания

афлатоксина B в исследуемом образце

1. Ориентировочное определение содержания афлатоксинов.

Ориентировочное определение содержания в исследуемом образце

афлатоксинов основано на визуальном сравнении интенсивности флуоресценции

обнаруженных пятен, характерных для афлатоксинов, на пластине с

интенсивностью флуоресценции пятен, полученных при внесении на эту пластину

различных количеств стандартных растворов афлатоксинов (А). При отсутствии

стандартных растворов афлатоксинов содержание афлатоксинов оценивают

визуально по минимальной (пороговой) видимой глазом флуоресценции

афлатоксинов на пластине с тонким слоем сорбента в ультрафиолетовом свете

(Б). Ориентировочное определение содержания афлатоксинов в образце может

быть также осуществлено при этом путем интенсивности обнаруженной

флуоресценции пятна афлатоксина B с интенсивностью флуоресценции пятен

бисульфата хинина, нанесенного на эталонную пластину сравнения из

стандартного раствора с определенной концентрацией хинина (В).

А. В первом случае предварительно готовят стандартный раствор

афлатоксинов. Наиболее токсичным и распространенным в продуктах питания

является афлатоксин B , поэтому с практической точки зрения очень важно

обнаружение именно этого вещества.

Стандартный раствор афлатоксина B может быть получен путем растворения

в хлороформе определенного количества чистого кристаллического афлатоксина.

Препараты чистого кристаллического афлатоксина B и других афлатоксинов

могут быть приобретены при обращении к следующим фирмам:

Calbiochem (США)

Афлатоксин B (крист.) кристаллизованный in situ из хлороформа; катал.

N 121741.

Афлатоксин g (кристал.) кристаллизованный in situ из хлороформа; кат.

N 121748.

Афлатоксин B и g аналогичные препараты с катал. N соотв. 121743 и

2 2

121749.

Sigma (Англия)

Препараты афлатоксинов с общим катал. N A 6636.

Senva (ФРГ)

Афлатоксин B (крист.) катал. N 11391 IVа.

Schuchazdt (ФРГ)

Афлатоксин B (кристал.), свободный от афлатоксинов B , g и g , катал.

1 2 1 2

N AF 012.

Афлатоксин B + g (растворенный в хлороформе; 4 мкг B + 0,75 мкг g ;

1 1 1 1

стандартизированные для тонкослойной хроматографии в ампулах); катал. N AF

010.

Афлатоксин B (ампулированный; практически свободный от остальных

афлатоксинов); катал. N 013.

Афлатоксин g (ампулированный; практически свободный от остальных

афлатоксинов); катал. N AF 014.

Афлатоксин g (ампулированный; практически свободный от остальных

афлатоксинов); катал. N AF 015.

Приготовление стандартного раствора афлатоксина B .

Оборудование и материалы

1. Колба мерная на 100 мл с притертой пробкой.

2. Пипетки измерительные на 0,1; 1 и 10 мл.

3. Весы аналитические.

4. Кристаллический афлатоксин B или стандартный ампулированный раствор

афлатоксина B в хлороформе.

5. Пробирки на 10 мл с нормальными шлифами и с притертыми пробками.

Для приготовления стандартного раствора, содержащего известную

концентрацию афлатоксина B , взвешивают на аналитических весах 0,0100 г

кристаллического афлатоксина B и растворяют навеску в 100 мл хлороформа.

Полученный таким образом раствор содержит 100 мкг афлатоксина B в 1 мл. Из

такого раствора путем трех последовательных разведений (каждое разведение

готовится из расчета 1 мл раствора + 9 мл хлороформа, т.е. каждый раствор,

начиная от исходного, разводят в 10 раз) получают раствор, содержащий в

общем объеме 10 мл 1 мкг афлатоксина B , а в 1 мл - соответственно 0,1

мкг последнего <*>.

--------------------------------

<*> Стандартные растворы афлатоксина B сохраняют в пробирках на 10 мл

с плотно притертой пробкой без доступа ультрафиолетового света при

температуре -18 °С.

При наличии готового ампулированного стандартного раствора афлатоксина

B , приобретенного у фирмы Schuchazdt (ФРГ, см. п. 1, подпункт А),

необходимо развести хлороформом общий объем, находящийся в ампуле, или,

наоборот, упарить его так, чтобы концентрация афлатоксина B составила 0,1

мкг в 1 мл. Следует отметить, что объем, равный 10 мл стандартного раствора

афлатоксина B , полученного как при растворении кристаллического

афлатоксина B в хлороформе, так и при разведении готового раствора на

ампулы, является достаточным для проведения 20 отдельных хроматографических

анализов в тонком слое сорбента. Общее исходное количество афлатоксина B -

10 мг - рассчитано на 200000 анализов.

Определение содержания афлатоксина B

в исследуемом образце при визуальном сравнении

со стандартным раствором афлатоксина B

Наносят на пластину пипеткой емкостью 0,1 мл 10 мкл стандартного

раствора афлатоксина B , разведенного предварительно хлороформом в два

раза, а также 15 и 30 мкл исходного стандартного раствора афлатоксина B .

Одновременно на эту же пластину наносят 180 мкл основного исследуемого

раствора, приготовленного в мерной колбе на 100 мл. На вторую пластину

наносят пипетками на 0,1 и 1 мл исходный стандартный раствор афлатоксина B

в количествах 100 и 250 мкл, а также, как и в предыдущем случае, 180 мкл

основного исследуемого раствора. При этом необходимо иметь в виду, что

наносимые пятна испытуемого раствора и раствора свидетеля должны иметь

приблизительно равный диаметр и находиться на расстоянии не менее 1,5 см

одно от другого. Проводят хроматографический анализ на тонком слое

сорбента, как указывалось в разделе 5. По окончании процесса хроматографии

просматривают обе пластины в ультрафиолетовом свете, помещая их на

горизонтальную поверхность приставки непосредственно перед светофильтром.

Сравнивают интенсивность флуоресценции обнаруженного в испытуемом растворе

пятна афлатоксина B с интенсивностью флуоресценции одного из пятен

свидетеля. Оценивают содержание афлатоксина B в исследуемом образце

продукта и степень токсичности последнего по следующей шкале (табл. 3).

Таблица 3

ШКАЛА ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ИССЛЕДУЕМОГО ПРОДУКТА

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ В НЕМ АФЛАТОКСИНА B

(ИСПОЛЬЗОВАН СТАНДАРТНЫЙ РАСТВОР АФЛАТОКСИНА B )

┌────────────┬─────────────────────────────────────┬─────────────┐

│ Количество │ Содержание афлатоксина B в сухом │ Степень │

│нанесенного │ 1 │ токсичности │

│стандартного│продукте (мкг/кг) в случае совпадения│ продукта │

│ раствора │интенсивности флуоресценции пятна из │ │

│афлатоксина │180 мкл испытуемого раствора и одного│ │

│ B (мкл) │ из пятен стандарта │ │

│ 1 │ │ │

├────────────┼─────────────────────────────────────┼─────────────┤

│10 <*> │15 │Очень слабая │

│15 │45 │Слабая │

│30 │90 │Средняя │

│100 │300 │Высокая │

│250 │750 │Очень высокая│

└────────────┴─────────────────────────────────────┴─────────────┘

--------------------------------

<*> Первое пятно свидетеля в объеме 10 мкл наносят из стандартного

раствора афлатоксина B , предварительно разведенного хлороформом в два

раза.

Окончательное заключение об обнаруженном количестве афлатоксина B в

исследуемом продукте должно быть сделано в пересчете на кг сырого продукта;

т.е. с учетом содержания влаги, удаляемой в процессе высушивания образца.

Б. Во втором случае, исходя из того, что при использовании описанной

выше стандартной ртутно-кварцевой горелки ПРК-4 начальную флуоресценцию

можно наблюдать визуально, начиная с содержания афлатоксина B в пятне на

пластине - 0,0005 мкг. После нанесения на пластину основного исследуемого

раствора в количествах 180, 60 и 30 мкл и проведения хроматографического

анализа (см. раздел 5) оценивают содержание афлатоксина B в исследуемом

образце и степень токсичности загрязненного афлатоксином продукта по

следующей шкале (табл. 4). При высокой концентрации афлатоксина B в

продукте (более 90 мкг/кг сухого веса) основной раствор (100 мл),

соответствующий 20 г сухого образца, разводят хлороформом в 30 раз.

Таблица 4

ШКАЛА ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ТОКСИЧНОСТИ ИССЛЕДУЕМОГО ПРОДУКТА

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ В НЕМ АФЛАТОКСИНА B

(БЕЗ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СТАНДАРТНОГО РАСТВОРА АФЛАТОКСИНА B )

┌──────────────────┬───────────────────────────────┬─────────────┐

│ Количество │ Содержание афлатоксина B │ Степень │

│ нанесенного │ 1 │ токсичности │

│ исследуемого │ в сухом продукте (мкг/кг) │ продукта │

│ раствора (мкл) ├───────────────┬───────────────┤ │

│ │ Флуоресценция │ Флуоресценция │ │

│ │ НЕТ │ ЕСТЬ │ │

├──────────────────┼───────────────┼───────────────┼─────────────┤

│Основной раствор │ │ │ │

│180 │< 15 │> 15 │Очень слабая │

│60 │< 45 │> 45 │Слабая │

│30 │< 90 │> 90 │Средняя │

├──────────────────┼───────────────┼───────────────┼─────────────┤

│Основной раствор │ │ │ │

│разведен в 30 раз │ │ │ │

│250 │< 300 │> 300 │Высокая │

│100 │< 750 │> 750 │Очень высокая│

└──────────────────┴───────────────┴───────────────┴─────────────┘

Окончательное заключение об обнаруженном количестве афлатоксина B в

исследуемом образце продукта, как и в первом случае, должно быть сделано в

пересчете на кг сырого продукта.

В. Приготовление стандартных растворов бисульфата хинина и подготовка эталонной пластины сравнения. Оборудование и материалы

1. Колба мерная на 500 мл.

2. Пипетки измерительные на 0,2; 0,1; 10,0 мл.

3. Хинин сернокислый (порошок, отвечающий требованиям Государственной фармакопеи СССР) - 100 мг.

4. Кислота серная 0,1 (х.ч.) - 0,6 л.

На аналитических весах взвешивают 0,0500 г порошка сернокислого хинина и растворяют его в 0,1 растворе серной кислоты в мерной колбе на 500 мл. После полного растворения раствор доводят до метки с помощью 0,1 серной кислоты. Полученный таким образом раствор содержит 100 мкг бисульфата хинина в 1 мл. Из этого раствора путем последовательных разведений (каждое разведение готовится из расчета 1:9, т.е. в 10 раз) приготавливают в пробирках на 5 мл с притертыми пробками ряд следующих концентраций бисульфата хинина в 0,1 серной кислоты: 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 мкг вещества в 1 мл. Пробирки, плотно закрытые пробками, сохраняют в защищенном от света прохладном месте.

Подготавливают пластинку с тонким слоем сорбента, как указывалось выше. После высушивания и активирования сорбента на пластине вдоль ее края, имеющего протяженность 12 см, на расстоянии 2 см от начала наносят с помощью микропипетки на 0,2 мл по 0,1 мл растворов бисульфата хинина. Полученные пятна должны иметь диаметр, приблизительно равный 1 см, и находиться на расстоянии не менее 1,5 см одно от другого. На приготовленной в этих условиях эталонной пластине сравнения пятна бисульфата хинина располагаются в следующей последовательности слева направо от меньшей концентрации бисульфата хинина к большей:

Пятно N 1 0,0001 мкг в пятне 0,001 мкг/мл в растворе

Пятно N 2 0,001 мкг в пятне 0,01 мкг/мл в растворе

Пятно N 3 0,01 мкг в пятне 0,1 мкг/мл в растворе

Пятно N 4 0,1 мкг в пятне 1 мкг/мл в растворе

Пятно N 5 1 мкг в пятне 10 мкг/мл в растворе.

Расположенные таким образом пятна со стандартными концентрациями бисульфата хинина при просматривании в ультрафиолетовом свете будут иметь ярко-голубую флуоресценцию, интенсивность которой находится в прямой пропорциональной зависимости от концентрации бисульфата хинина. Пластину сохраняют без доступа ультрафиолетового света.

Определение содержания афлатоксина B в исследуемом образце

при помощи эталонной пластины сравнения

Просматривают одновременно на приставке в ультрафиолетовом свете:

пластину с нанесенным исследуемым экстрактом образца <*> после

предварительной идентификации полученных пятен и выявления наличия в

анализируемом продукте афлатоксина B , а также пластину-эталон со

стандартными растворами бисульфата хинина. Сравнивают по интенсивности

флуоресценции пятен афлатоксина B с каждым из имеющихся пятен бисульфата

хинина, причем сравниваемые пятна должны иметь одинаковый диаметр.

Устанавливают сходство исследуемого пятна с определенным пятном хинина.

Оценивают содержание афлатоксина B в исследуемом продукте, пользуясь

приводимой ниже шкалой (табл. 5).

--------------------------------

<*> Основной раствор афлатоксинового экстракта должен быть

предварительно упарен до объема 1 мл; на пластину при этом наносят 10, 50 и

100 мк упаренного раствора.

Таблица 5

СОДЕРЖАНИЕ АФЛАТОКСИНА B В ОБРАЗЦЕ СУХОГО ПРОДУКТА (МКГ/КГ)

┌──────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│ Количество │ Порядковый номер пятна бисульфата хинина │

│ основного │ на пластине сравнения │

│ исследуемого ├─────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┤

│раствора (мкл)│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │

├──────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤

│100 │0,5 │5 │50 │500 │5000 │

│50 │1 │10 │100 │1000 │10000 │

│10 │5 │50 │500 │5000 │500000 │

└──────────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┘

Оценку степени токсичности продукта при этом производят в соответствии с указаниями, приведенными в разделе "А" и "Б" к табл. 3 и 4.

2. Точное определение содержания афлатоксина B .

Для осуществления точного экспертизного контроля за обнаружением

загрязнения афлатоксином B продуктов необходимо, прежде всего, проведение

исчерпывающей экстракции афлатоксинов из образца (не менее 5

последовательных экстракций по 30 мин. со сменой растворителя-экстрагента).

Количественное определение концентрации афлатоксина B в исследуемом

образце и оценку степени токсичности продукта основывают при этом не на

визуальном, а на спектрофотометрическом анализе элюатов, полученных из

обнаруженных предварительно на тонком слое сорбента пятен афлатоксина B в

экстракте из образца; производят расчет по формуле, предложенной Nabney и

Nesbitt (1965).

Необходимо иметь в виду, что в качестве предельно допустимого

содержания афлатоксинов в арахисе и продуктах, приготовленных из него,

семенах масличных следует принять дозу, рекомендуемую Комитетом экспертов

ВОЗ, - 30 мкг афлатоксина B в 1 кг сырого продукта. Что же касается таких

зерновых продуктов, как пшеница, рис, соя и некоторых других, в связи с

достаточно широким потреблением этих продуктов в нашей стране

вышеприведенная предельно допустимая доза афлатоксина B должна быть

уменьшена в три раза (до 10 мкг афлатоксина B на 1 кг данных продуктов).

Литература

1. Богородицкая В.П., Нефедьева Н.П. В кн.: "Материалы симпозиума по микотоксинам", Киев, "Наукова Думка", 1972, стр. 89.

2. Николаева М.Я., Щербакова А.И., Лашнева Н.В., Коровников К.А., Черняева Е.В. В кн.: "Материалы XVII научной конференции Института питания АМН СССР", Москва, 1971, стр. 124.

3. Покровский А.А. В кн.: "Проблемы медицинской энзимологии", Москва, "Медицина", 1970, стр. 26.

4. Покровский А.А., Вальдес-Мендоса В.С., Стенева М.П., Лашнева Н.В., Смирнова Л.А., Кравченко Л.В., Касаткина М.Н. "Вопросы питания", т. 28, N 6, стр. 8, 1969.

5. Покровский А.А., Николаева М.Я., Нефедьева Н.П., Богородицкая В.П. "Вопросы питания", т. 30, N 4, стр. 69, 1971.

6. Покровский А.А., Николаева М.Я., Лашнева Н.В., Гаппаров М.М.-Г., Щербакова А.И., Коровников К.А., Апенова Н.Н. "Вестник АМН СССР", N 1, стр. 48, 1972.

7. Alma J.K., Kamala C.S., Gopalakrishna G.S., Jayaraj A.P., Sreenivasamurthy V., Parpia H.A.B., Am. j. Clin. Nutr., v. 24, p. 609, 1971.

8. Alma J., Shyamala K., Sreenivasamurthy V., Jayaraj A.P., Parpia H.A.B., Indian Pediatrics, v. 7, p. 262, 1970.

9. Alpert M.E., Hutt M.S.R., Wogan G.N., Davidson C.S., Cancer, v. 28, p. 253, 1971.

10. Kumar O.V., Sampath S.R., Indian J. Nutr. Diet., v. 8, p. 85, 1971.

11. Lopes A., Crawford M.A., Lancet, v. 2, p. 1351, 1967.

12. Nabney J., Nesbitt B.F., Analyst, v. 90, p. 155, 1965.

13. Tung T.C., Ling K.H.J., Vitamin (Kyoto), v. 14, p. 48, 1968.

Интернет архив законодательства СССР. Более 20000 нормативно-правовых актов.
СССР, Союз Советских Социалистических республик, Советская власть, законодательство СССР, Ленин, Сталин, Маленков, Хрущев, Брежнев, Андропов, Черненко, Горбачев, история СССР.

© LibUSSR.RU, 2011 - 2024