Утверждены
Минздравом СССР
27 сентября 1978 г. N 1918-78
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЭТРЕЛА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ
(ГИДРЕЛА,
ДИГИДРЕЛА) В ЯБЛОКАХ, ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ, ЗЕРНЕ
ЗЛАКОВ,
СЕМЕНАХ ХЛОПЧАТНИКА И ХЛОПКОВОМ МАСЛЕ
МЕТОДОМ
ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны
К.Ф. Новиковой, Т.В. Алдошиной, Ф.Р. Мельцер (ВНИИХСЗР).
Краткая
характеристика препарата. Этрел
(этефон) - препарат,
действующим началом которого
является
2-хлорэтилфосфоновая кислота.
Брутто-формула C H O ClP.
Молекулярная масса 144,5.
Общепринятое
2 6 3
название -
кампозан. Представляет собой твердое кристаллическое вещество
белого цвета с
т. пл. 74 - 76 °C. Быстро
растворяется в гидрофильных
растворителях, в воде,
спирте. В водных
растворах при pH
ниже 3,5
стабилен, при
pH выше 3,5
разлагается. Препарат гигроскопичен.
Применяется в сельском хозяйстве в качестве регулятора
роста растений.
К
производным этрела относятся
гидрел и дигидрел. Это отечественные
препараты, рекомендуемые
для применения в
качестве регуляторов роста
растений.
Брутто-формула гидрела
C H O N CL P . Молекулярная масса 321.
4 16 6 2 2 2
Брутто
формула дигидрела C H O N Cl P .
Молекулярная масса 349. Эти
6 20 6 2 2 2
вещества хорошо
растворяются в воде
и спиртах. В
ацетоне могут
разлагаться с
отщеплением гидразина.
ДСД гидрела 0,003 мг/кг; МДУ в картофеле,
томатах, огурцах, яблоках, черешне, мандаринах, хлопковом масле, семенах
хлопчатника 0,15 мг/кг. ДСД этрела 0,006 мг/кг; МДУ в томатах, огурцах, зерне
хлебных злаков 0,5 мг/кг.
Принцип метода. Метод основан на
извлечении этрела из анализируемого объекта метанолом, а производных этрела -
смесью метанола с ацетоном (1:1), этерификации с помощью диазометана, очистке
экстракта перераспределением метилового эфира хлорэтилфосфоновой кислоты из
водной фазы в этилацетат с последующим газохроматографическим определением с
применением ТИД.
Метрологическая характеристика метода.
Предел обнаружения 1 нг в 3 мкл хроматографируемой пробы. Предел определения
0,15 мг/кг (огурцы, томаты, яблоки) и 0,5 мг/кг (семяна злаковых, хлопчатника и
хлопковое масло). Среднее значение определения для овощей и
фруктов 79,9%, для семян злаковых, хлопчатника и хлопкового масла - 63,8%.
Стандартное отклонение для овощей и фруктов +/- 7,1%, для семян хлопчатника и
хлопкового масла +/- 4,9%. Доверительный интервал среднего (при p = 0,95 и n =
5) для овощей и фруктов +/- 7,1, для семян злаковых, хлопчатника и хлопкового
масла +/- 4,9%.
Реактивы и растворы. Метанол
х.ч. Этанол х.ч. Ацетон х.ч. Гексан х.ч. Серный эфир абсолютированный.
Этилацетат х.ч., свежеперегнанный. Хлороводородная кислота, 10-процентный
раствор в метаноле. Едкое кали х.ч., чешуированное. Едкое кали, 50-процентный
раствор в воде. Нитрозометилмочевина. Диазометан свежеприготовленный. Нитрит
натрия х.ч. Метиламин, 24-процентный водный раствор. Мочевина х.ч. Хлорид
натрия х.ч. Сульфат натрия безводный х.ч. Стандартные растворы этрела, гидрела
и дигидрела в метаноле и ацетоне с содержанием 100 и 10 мкг/мл. Хлорид кальция
безводный. Серная кислота 1 н.
Для получения абсолютного серного эфира
серный эфир сушат над безводным хлоридом кальция в течение нескольких дней (12
г хлорида кальция на 100 мл эфира). Эфир фильтруют в колбу для перегонки
растворителей, туда же помещают мелко нарезанные кусочки металлического натрия
и перегоняют эфир в приемник, снабженный алонжем и хлоркальциевой трубкой.
Для получения нитрозометилмочевины во
взвешенную колбу вместимостью 1 л наливают 200 г (1,5 М) 24-процентного водного
раствора метиламина и добавляют концентрированную хлороводородную кислоту до
кислой реакции по метилкрасному (около 150 мл). Затем добавляют до 500 г
дистиллированную воду и 300 г 5 М мочевины. Полученный раствор осторожно
кипятят с обратным холодильником при умеренном нагревании в течение 3 ч.
Усиливают нагрев и кипятят энергично еще 15 мин. Раствор охлаждают до комнатной
температуры и растворяют в нем 110 г (1,5 М) нитрита натрия. Охлаждают раствор
до 0 °C в смеси льда с хлоридом натрия.
В стакане вместимостью 3 л готовят смесь
из 600 г льда и 100 г 1 н концентрированной серной кислоты. К раствору при
охлаждении стакана в смеси льда с хлоридом натрия медленно приливают при
помешивании механической мешалкой холодный раствор метилмочевины и нитрита
натрия. Температура раствора не должна подниматься выше 0 °C.
Нитрозометилмочевина всплывает на поверхность в виде кристаллов. Кристаллы
отфильтровывают и отсасывают под вакуумом, затем размешивают их с 50 мл
холодной воды до образования пасты и снова отсасывают. Сушат кристаллы в
вакуумном эксикаторе до постоянной массы. Выход 105 - 115 г. Хранить
нитрозометилмочевину нужно в темной склянке в холодильнике, так как под
действием света и тепла она может взорваться.
Вещество ядовито! Следует избегать
попадания на кожу.
Диазометан (т. кип. 24 °C) - взрывчатое и
очень ядовитое вещество. Целесообразно получать его только в растворах.
Растворы даже на холоде устойчивы лишь в течение нескольких дней. Лучше всего
их использовать свежеприготовленными. Сосуд с
диазометаном нужно закрывать корковой пробкой и хранить в холодильнике. В
круглодонную колбу вместимостью 500 мл помещают 30 мл 50-процентного водного
раствора едкого кали и 100 мл абсолютированного серного эфира. Смесь охлаждают
льдом до 5 °C, после чего при взбалтывании через химическую воронку небольшими
порциями добавляют 10,3 г (0,1 М) нитрозометилмочевины. Колбу присоединяют к
обратному холодильнику, противоположный конец которого снабжен алонжем,
проходящим через резиновую или корковую пробку с двумя отверстиями и
погруженным в 40 мл абсолютированного серного эфира, находящегося в конической
колбе вместимостью 200 мл. Приемная колба погружена в охлаждающую смесь льда и
соли. Реакционную колбу переносят в водяную баню, нагретую до 40 °C, и
перегоняют образующийся диазометан, время от времени
взбалтывая содержимое колбы. Отгонку диазометана прекращают, как только
дистиллят в холодильнике становится бесцветным. Обычно это наступает после
того, как отогнаны 2/3 эфира. Ни в коем случае нельзя
отгонять весь эфир! Оставшиеся на дне колбы перекисные соединения взрывоопасны!
Приборы и посуда. Хроматограф
"Цвет-106" или аналогичный, снабженный ТИД. Стеклянные колонки длиной
1 м с внутренним диаметром 3,5 мм. Механический встряхиватель. Делительные
воронки на 100 мл. Ротационный вакуумный испаритель. Установка для получения
диазометана. Колбы: круглодонные на 500 мл со шлифом; плоскодонные на 250 мл со
шлифом; грушевидные на 25 мл; конические на 100 мл; мерные на 100 мл. Мерные
цилиндры. Пробирки градуированные на 5 мл. Пипетки на
2; 5 и 10 мл. Микрошприцы вместимостью 10 мкл.
Ход анализа. Экстракция. Измельченные
яблоки (10 г) помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 20 г безводного
сульфата натрия и 70 мл метанола - для извлечения этрела или смеси метанола с
ацетоном (1:1) - для извлечения гидрела или дигидрела. Смесь
встряхивают на механическом встряхивателе 30 мин. Экстракт фильтруют в
круглодонную колбу и повторяют экстракцию тем же количеством растворителя в
течение 30 мин. К объединенному экстракту добавляют 0,5 мл 10-процентного
раствора хлороводородной кислоты в метаноле и отгоняют растворитель на
ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 35 °C до объема 5 - 10
мл. К остатку приливают эфирный раствор диазометана до появления
постоянного желтого цвета. Обычно требуется 10 - 13 мл свежеприготовленного
раствора метилирующего реагента.
Колбу прикрывают корковой пробкой и
оставляют в покос на 15 - 20 мин. Избыток диазометана отгоняют на ротационном
испарителе без нагревания. Остаток (10 мл) смывают метанолом в делительную
воронку на 100 мл. Полученный объем вдвое разбавляют дистиллированном водой,
прибавляют 5 - 7 г хлорида натрия и 20 мл гексана. Энергично встряхивают смесь
несколько секунд. Дают слоям разделиться, нижний слой переносят в делительную
воронку, а верхний, гексановый, отбрасывают. Метиловый эфир хлорэтилфосфоновой
кислоты экстрагируют из водной фазы этилацетатом порциями 20 мл и еще два раза
по 10 мл. Этилацетатный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия в течение
10 - 20 мин., фильтруют в грушевидную колбу на 50 мл и отгоняют растворитель на
ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 30 - 35 °C до 1 - 1,5 мл.
Остаток количественно переносят в градуированную пробирку и доводят объем до 5
мл этилацетатом. В хроматограф вводят 3 мкл полученного раствора. Если раствор
до хроматографирования должен стоять более 1 ч, нужно держать его на холоде.
К 10 г измельченного образца огурцов,
томатов добавляют 100 г безводного сульфата натрия и 70 мл соответствующего
экстрагента. Экстракцию проводят так же, как из яблок. Экстракт сушат над 30 г
безводного сульфата натрия, фильтруют в колбу прибора для отгонки растворителя,
добавляют 0,5 мл 10-процентного раствора хлороводородной кислоты в метаноле и
отгоняют растворитель до объема 10 мл. Проводят метилирование. После удаления избытка
диазометана остаток смывают метанолом в делительную воронку, разбавляют вдвое
водой, добавляют 5 - 7 г хлорида натрия и 20 мл гексана. Смесь энергично
встряхивают, дают слоям разделиться, нижний водный слой переносят в другую
делительную воронку, а гексановый слой отбрасывают. Эту операцию повторяют еще
два раза порциями по 10 мл. Метиловый эфир хлорэтилфосфоновой кислоты
экстрагируют из водной фазы этилацетатом по 20; 10 и 10 мл. Далее поступают так
же, как с образцом яблок.
Навеску размолотых семян злаковых и
хлопчатника (10 г) помещают в круглодонную колбу на 500 мл, заливают 100 мл
смеси метанола с ацетоном (1:1). Содержимое колбы встряхивают 30 мин. на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют через
бумажный фильтр в круглодонную колбу. Экстракцию проводят еще дважды тем же
растворителем порциями по 100 мл. К объединенному экстракту добавляют 0,5 мл
10-процентного раствора хлороводородной кислоты в метаноле и отгоняют
растворитель с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 15 - 20 мл.
Колбу с экстрактом помещают в испаритель холодильника на 5 - 6 ч,
предварительно закрыв пробкой. Охлажденный раствор фильтруют через бумажный
фильтр, который содержит 5 - 7 г безводного сульфата натрия. Стенки колбы
обмывают охлажденным метанолом, который также пропускают через фильтр. В
фильтрат добавляют 25 мл высушенного серного эфира, содержимое колбы тщательно
перемешивают. Через несколько минут к фильтрату снова добавляют 15 мл серного
эфира. Выпавший белый осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Фильтрат
упаривают до объема 10 мл. К раствору приливают 2 мл абсолютного метилового
спирта и 25 мл свежеприготовленного диазометана. Неплотно закрыв колбу корковой
пробкой, оставляют раствор на 30 - 40 мин. Затем отгоняют избыток диазометана
на ротационном вакуумном испарителе без обогрева колбы. Остаток (10 мл)
переносят метанолом в делительную воронку и далее экстракт очищают по такой же
схеме, как образец яблок.
Навеску хлопкового масла (10 г) помещают
в делительную воронку на 100 мл. Производные этрела трижды экстрагируют из
масла этиловым спиртом порциями по 30 мл. Объединенный спиртовой экстракт
помещают в круглодонную колбу на 200 мл и отгоняют растворитель до объема 15 -
20 мл с помощью ротационного вакуумного испарителя, предварительно добавив в
него 0,5 мл 10-процентного раствора хлороводородной кислоты в метаноле. Колбу с
экстрактом помещают в испаритель холодильника на 5 - 6 ч и далее проводят такие
же операции, как с семенами хлопчатника.
Условия
хроматографирования.
Хроматограф "Цвет-106" с ТИД. Скорость
-10
протяжки ленты
самописца 0,33 см/мин. Рабочая шкала электрометра 10 x 10
А. Стеклянная колонка длиной 1 м, диаметром 3,5
мм заполнена хромосорбом W
(100 -
120 меш), промытым кислотой и силанизированным DMCS с 5% SE-30.
Температура колонки
110 °C, испарителя
140 °C. Скорость газа-носителя
(азота) 40
мл/мин., водорода - 18 - 20 мл/мин., воздуха - 180 - 200 мл/мин.
Время
удерживания эфира в этих условиях 2 мин. 15 сек. В хроматограф вводят
3 мкл раствора.
Линейность детектирования сохраняется в пределах 1 - 20 нг.
Альтернативная колонка. Стеклянная
колонка длиной 1,2 м с внутренним диаметром 3 мм. Заполнена
хроматоном N-AW-HCDS (0,16 - 0,20 мм) с 10% полипропиленгликоль адипината.
Температура колонки 170 °C, испарителя - 200 °C. Скорость потока газа-носителя
(азота) 75 мл/мин., водорода - 18 - 20 мл/мин., воздуха - 200 мл/мин. Время
удерживания эфира в этих условиях 2 мин. 45 с.
Приготовление стандартов для сравнения с
рабочей пробой. В ряд грушевидных колб вносят различное количество стандартных
растворов этрела (гидрела, дигидрела) с содержанием 10 мкг/мл. Растворы доводят
до 2 мл метанолом, приливают 5 - 6 мл эфирного раствора диазометана и, закрыв
пробкой, оставляют на 15 мин. в покое. Избыток диазометана отгоняют на
ротационном вакуумном испарителе без нагрева. Остаток смывают метанолом в
делительную воронку, разбавляют вдвое водой, добавляют 5 - 7 г хлорида натрия и
экстрагируют метиловый эфир хлорэтилфосфоновой кислоты этилацетатом порциями 20
мл, затем два раза по 10 мл. Объединенный экстракт сушат над безводным
сульфатом натрия, фильтруют в грушевидную колбу на 50 мл и отгоняют
растворитель на ротационном испарителе при температуре бани 30 - 35 °C до
объема 1 - 1,5 мл. Остаток количественно переносят в градуированную пробирку и
доводят объем раствора до 5 мл этилацетатом. В хроматограф вводят 3 мкл
полученного раствора.
Обработка результатов анализа.
Количественное определение проводят методом соотношения со стандартами по
высоте пиков. Содержание действующего вещества в анализируемой пробе (X, мг/кг)
вычисляют по формуле:
H C V
п ст
X = ------,
H V P
ст а
где:
H -
высота пика анализируемой пробы, мм;
п
H -
высота пика стандарта, мм;
ст
C -
содержание анализируемого вещества в стандарте, нг;
ст
V
- объем конечного
раствора, из которого
отбирают пробу для
хроматографирования,
мл (5 мл);
V -
объем аликвоты, которую вводят в хроматограф, мкл (3
мкл);
а
P - навеска анализируемого образца, г (10 г).
Требования безопасности. Следует
соблюдать правила безопасности при работе с серным эфиром. Перегонку эфира
необходимо вести на водяной бане. Полное отсутствие открытого огня в помещении!
Отгонять эфир полностью нельзя, так как в колбе остаются взрывоопасные
перекисные соединения. Соблюдать меры безопасности при работе с
нитрозометилмочевиной и диазометаном. Работу проводить под тягой, в перчатках.